然而，當一種引物的濃度受限時，反應產生的單鏈DNA以算術級數累積。到反應結束，DNA某一條鏈的濃度比另一條多3~5倍(Scully et al. 1990)。 均一標記的探針可以通過在PCR反應中摻入放射性標記核苷酸來製備( Bird 2005)。
●通過在含有雙鏈DNA模板和僅有一個引物的熱循環反應中合成全部是一條鏈的放射性標記探針。經過40個循環，雙鏈模板DNA (20μg)產生約200ug的單鏈探針。
探針的長度可以通過在模板DNA上探針結合位點的下遊選取酶切位點加以限定(Stirzl and Roth 1990a,b).
●通過轉錄連在噬菌體啟動子上的線形雙鏈DNA模板可以產生均一標記的RNA探針(核糖核酸探針) (Melton et al. 1984)。DNA模板的製備還可以通過用限制性內切核酸酶切割克隆在質粒上的DNA序列的內部或其下遊酶切位點獲得，也可以採用PCR方法獲得。
線性化的模板在[a-p] NTP存在的條件下由合適的、噬菌體來源的、DNA依賴的RNA聚合酶轉錄，產生長度為從模板DNA片段啟動子的起始位點到其終點的標記的RNA。
啟動子和DNA序列按照一定的方向排列，從而使得到的核糖核酸探針與待分析的mRNA是反義(互補)的。
嚴謹的但並非必需的後續工作是用變性膠電泳純化RNA探針。純化可以用含8mol/L 尿素的5%聚丙烯醯胺凝膠在微型蛋白凝膠裝置中方便、快速地進行(如Bio-Rad Mini-PROTEAN)。