反應特異性的提高源於和相同模板結合的兩套獨立的引物

2020-12-05 歷史小咖咖會

先後使用兩對引物可使循環數倍增，從而提高了PCR的靈敏度。反應特異性的提高源於和相同模板結合的兩套獨立的引物。巢氏PCR對於擴增長模板片段是一-種有效的方法，但是需要知道靶基因的序列。

在「半巢氏PCR」中，第二次擴增使用的一條引物與第一次PCR中兩條外引物的其中一條完全相同(Zhang and Ehrlich 1994)。半巢氏PCR的特異性可能較常規的巢式PCR稍差，但是兩種技術在靈敏度上相近。

RT-PCR是從低拷貝mRNA中合成和檢測cDNA的有效方法。該方法需要兩種酶：反轉錄酶和熱啟動DNA聚合酶。mRNA在反轉錄酶作用下生成單鏈cDNA拷貝，該擴增產物隨後可作為模板，通過熱啟動DNA聚合酶進行擴增反應。

本方案描述了傳統RT-PCR，即兩步合成反應按順序分開進行。所以，該方法也叫兩步法RT-PCR (two-step RT-PCR)。

第一鏈合成的引物依據實驗目的，針對cDNA第一鏈合成的引物可依據靶基因設計，該引物可與靶基因特異結合：也可用oligo (dT) 或隨機引物，該引物可結合所有mRNA.●oligo (dT),

能與哺乳動物mRNA的內源poly (A)尾相結合，作為通用引物用於第一鏈cDNA的合成。後續PCR擴增可用-條或多條基因特異性引物與oligo (dT)配對來產生一種特異 的mRNA 3'端序列的拷貝(3'-RACE，參見方案10)

相關焦點

  • 擴增反應是使用通用引物AMix 和基因特異性引物來執行的
    在到達RNA模板尾部時，該聚合酶會表現出末端轉移酶活性，在第一鏈cDNA的3』端加入3~5個核苷酸。3.試劑盒提供的SMARTer寡核苷酸末端延伸出一些修飾鹼基，可與第一-鏈cDNASMARTer寡核苷酸引物和RNA一端結合後，可以合成完整的雙鏈cDNA拷貝。
  • 第一鏈cDNA會作為模板,通過基因特異性引物和接頭引物得以擴增
    Poly(A)t RNA製備產物首先使用小牛腸磷酸酶去除汙染rRNA、tRNA和RNA片段5'端磷酸殘基。脫磷酸化的RNA在後續RNA連接酶作用下不能進行連接反應。2.用酚-氯仿抽提法去除磷酸酶，RNA 產物再用菸草酸焦磷酸酶處理，其目的是水解帽子結構區三磷酸鍵橋上的磷酸酐鍵並暴露出一個5'端磷酸殘基。
  • RT-PCR引物的選擇
    主要用於單一模板的RT-PCR反應。與模板序列互補的引物，適用於目的序列已知的情況。引物特異性差重新設計引物，改變引物的位置和長度，增強其特異性或使用巢式，確定對於每個模板和引物對的最佳鎂離子濃度。操作多份樣品時，製備反應混合液，先將dNTP、緩衝液、引物和酶混合好，然後分裝，這樣即可以減少操作，避免汙染，又可以增加反應的精確度；5.
  • PCR專題,引物設計
    在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟體（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。2.引物長度一般在15~30鹼基之間。引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA 聚合酶進行反應。
  • 引物(primers)設計知識介紹
    引物（primers)引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區域另一端的另一條DNA模板鏈互補。引物的重要性在整個PCR體系中, 引物佔有十分重要的地位。
  • 消滅PCR非特異性擴增的黃金方法
    雖然度過了初學者們少加漏加PCR體系的階段，但很多奮戰在實驗室一線的小夥伴正遭遇著PCR非特異性擴增的尷尬事件。為了解決這個問題，有多少人曾經把退火溫度從50℃試到70℃、重新合成過引物、換過模板、換過全新的電泳緩衝液，或者還帶著滿腔的憤怒捏碎過電泳膠？今天老談來教教大家如何對非特異性擴增嗤之以鼻！
  • 恆溫核酸擴增反應引物探針設計問題合集
    RPA和ERA的擴增引物可以說是整個反應的關鍵所在，那麼怎樣才能設計好其引物呢？某些情況可能用到少於30個核苷酸的引物，但擴增過程會顯著減緩。ERA 引物需要多長？ 為了充分利用 ERA 的檢測速度和靈敏度，我們建議客戶使用 29-32 個核苷酸長 度的引物。通常情況下，PCR 引物可用於 ERA 反應體系，但這類引物的檢測速 度和靈敏度可能不及較長的引物。
  • 多重等位基因特異性PCR通用晶片在聽力篩查中的應用
    材料與方法 2.1 樣品 已經作過分型的病人DNA樣品分別由下列單位提供：中國人民解放軍總醫院，中國醫學遺傳學國家實驗室；Thomas Jefferson大學；史丹福大學醫學院；布拉格Charles大學。
  • 巢式PCR一般適用於一些有必要增加靈敏度或特異性的PCR反應
    這些DNA片段通過連接環化，然後從已知序列中設計反向延伸的特異引物來擴增已知序列間的未知序列。擴增產物是一條線性DNA片段，其中包含有最初用於消化DNA的限制性酶切位點。這個位點是以前克隆的已知序列與其側翼未知序列的交界。擴增片段大小依賴於已知序列和側翼區域中限制性酶切位點的分布。
  • 自動DNA合成儀合成的引物無需進一步純化即可用於標準PCR反應
    ●引物。影響擴增反應的效率和擴增特異性的因素很多，最為關鍵的是寡核苷酸引物的設計。仔細地設計引物，可獲得所需片段的高產量擴增，抑制可能的、非特異性的、不必要的序列擴增，便於擴增產物的後續操作。雖然引物的效率在很大程度上影響到PCR反應的成敗，但是，它們的設計準則更多的是基於常識，而不是眾所周知的熱力學和結構學原理。
  • PCR儀能實現引物的延伸功能
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  • 如何設計PCR引物
    常用的為18-27bp，但不應大於38bp，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA聚合酶進行反應； 2、引物GC含量一般為40%-60%， 45-55%為宜，GC含量過高或過低都不利於引發反應。
  • 實驗時間 | 聚合酶鏈式反應(PCR)
    PCR 技術的基本原理類似於 DNA 的天然複製過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR 由變性 -- 退火 -- 延伸三個基本反應步驟構成：模板 DNA 的變性：模板 DNA 經加熱至 94 ℃ 左右一定時間後，使模板 DNA 雙鏈或經 PCR 擴增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備；模板 DNA 與引物的退火 (復性)：模板 DNA 經加熱變性成單鏈後，溫度降至 55 ℃ 左右，引物與模板
  • 反轉錄引物—— Oligo(dT)
    通常RT primer可分為三類：oligo dT，隨機引物以及基因特異性引物。
  • 引物合成介紹(5)
    25.用軟體設計的引物為什麼不管用？答：引物是否好用，能否擴增出您需要的引物，與是否用軟體設計沒有太多的關係。引物設計有一定的指導意見，軟體就是根據這些要求設計而成。不要迷信軟體給您設計的引物，軟體中一些參數您可能不明白，弄錯了反而麻煩。其實，PCR擴增的成敗最關鍵的是反應模板的製備和反應條件的控制。
  • 逆轉錄-聚合酶鏈反應
    Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，採用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用於：分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。一、反轉錄酶的選擇1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃。
  • 多重PCR反應中關鍵因素和實驗步驟(3)
    隨著 MgCl 2 濃度的逐漸升高，擴增反應的特異性逐漸增強（非特異性條帶消失），產物量逐漸增多 (10.8 mM) 。在 MgCl 2 濃度為 20 mM 的 PCR 反應中，產物幾乎不可見，似乎反應被抑制了。 dNTP/MgCl 2 的平衡 .
  • 第三節 PCR操作範例及反應體系的組成
    第三節　PCR操作範例及反應體系的組成 　　一、PCR操作範例 　　在一個典型的PCR反應體系中需加入：適宜的緩衝液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐熱性多聚酶、Mg2+和兩個合成的DNA引物。
  • 反義引物應該設置在引發cDNA合成的寡核苷酸的上遊
    ●cDNA 合成可用一種合成的反 義寡核苷酸引物來引發，該引物可選擇與特殊靶RNA或mRNA家族序列的某個區域雜交。特異cDNA片段能通過PCR擴增來獲得，而正義和反義寡核苷酸引物可根據cDNA具體序列來設計。
  • 引起AHPND的細菌特異性檢測引物免費公開
    引起AHPND的細菌特異性檢測引物免費公開2013-12-26 13:44:00　　水產養殖網　　出處：中國水產頻道        瀏覽量： 2616 次 我要評論 　　譯：蔡章潔/鄧美英　　以泰國T.W.Flegel教授以及臺灣羅竹芳教授未收的研究人員已經開發出引起AHPND的那株特異性副溶血性弧菌的PCR引物，