如何設計PCR引物

2021-03-02 捷瑞生物

今天，我們來嘮嘮如何利用NCBI設計PCR引物。還不知道怎麼設計引物的趕緊收藏起來啦。



1、引物長度一般在15-30bp。常用的為18-27bp，但不應大於38bp，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA聚合酶進行反應；

2、引物GC含量一般為40%-60%， 45-55%為宜，GC含量過高或過低都不利於引發反應。上下遊引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所對應的模板序列的Tm值最好在72℃左右。至少要在55-80℃之間。

4、引物3』端的鹼基一般不用A。A在錯誤引發位點的引發效率相對比較高。引物3』端出現3個以上的連續鹼基，如GGG或CCC，或者引物3』端的互補、二聚體或髮夾結構也可能導致PCR反應失敗。

5、鹼基要隨機分布，且引物自身和引物之間不能有連續4個鹼基的互補。

6、 儘量在Exon junction上設計引物，限制基因組DNA擴增。

7、 使用BLAST檢索，確認引物特異性。


那如何用NCBI設計引物呢？



首先我們要先找到NCBI網址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

然後需要知道對應的基因名稱和物種信息

例如我們要找人源的ACTB（β-actin）基因


1.打開NCBI網頁，在搜索欄裡輸入基因名稱和物種，前面的下拉框選擇  Gene，選好之後點擊搜索

2.搜索之後會出現以下界面，我們要看物種信息和我們基因名稱是不是我們需要的基因，紅色方框圈出來的地方就是我們的目標基因，找到之後點擊左邊的基因名稱

3.點擊之後會跳出基因的一些基本信息，這個時候可以再次核對是不是自己的目標基因

4.確認無誤之後往下拉找到該基因對應的核酸信息，找到之後點擊方框中的核酸信息

5.點擊之後就能看到對應的mRNA的序列信息，選擇自己需要的一段鹼基序列進行設計引物就可以啦



往下拉就能看到基因序列了




1.找到序列之後直接跳到NCBI的Primer-BLAST頁面，提交的界面主要包括四個部分：PCR template（模板區）, Primer Parameters（引物參數區）, 和Exon/intron selection（外顯子內含子選擇區），Primer Pair Specificity Checking Parameters（驗證引物特異性）。

2.在PCR Template下方文本框中我們也輸入FASTA格式的序列或Accession Number，或點擊"選擇文件"載入FASTA格式的文件。右側可以設置正向引物和反向引物的起始和終止位置。在"Primer Parameters"模塊，可以輸入PCR產物的大小（PCR product size）和Tm值參數。如何你已經設計好了引物，要拿來驗證引物的好壞，可以在此輸入。一般產物短設為大小最小值50，最大值設為300。引物Tm溫度接近，設置差2℃。


選擇引物設計跨越內含子，限制基因組DNA擴增。






3.Primer Pair Specificity Checking Parameters驗證引物的特異性，選擇設計引物或驗證引物時的目標資料庫和物種。這裡提供了6種資料庫：RefSeq mRNA, Refseq representative genomes，nr，RefseqRNA(refseq_rna)，Genomes for selected  organism, Custom。推薦使用"Refseq representative genomes"資料庫，Custom可以使用自己的序列作為搜索資料庫。 

 

4.用NCBI的參考序列作為模板和參考序列資料庫作為標準來設計引物時，Primer-BLAST可設計出只擴增某一特定剪接變異體基因的特異引物。跟其它的BLAST一樣，點擊底部的"Advanced parameters"有更多參數設置，但一般不用再增加參數設置了。

5.單擊Get primers，有時可能需要耐心等待一會，

出現結果界面，下圖是引物的可視化結果，該結果會顯示出所有引物的起始和終止位置，基因的CDS區，外顯子的位置等。


以及會給出每一個引物對的具體信息，包括引物序列，長度，起始終止位置，Tm值，GC含量，自身互補和3』端互補情況，PCR產物的長度和位置等。其中，Self complementarity和Self 3' complementarity的值越小越好。


雖然內容有點長，但是真的很實用哦。




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