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一頓操作猛如虎，一看戰績0-5。
儘管引物設計是PCR實驗成功的前提，但是蠻多小夥伴的實戰經驗稍顯不足。
今兒就向大家介紹2種引物設計方法。
This is the dividing line.
引 物 設 計
儘管是老生常談了，但是小編還是想先把引物設計的原則放出來(其實是複製粘貼啦，哪哪都有)。
1、引物應用核酸系列保守區設計並具有特異性。最好位於編碼區5'端的300-400bp區域內，可以用DNAMAN，Alignment軟體看看結果。
2、不能形成2級結構。
3、引物長度一般在17-25bp之間，上下遊引物不能相差太大。
4、G+C含量在40-60%之間，45-55%最佳。
5、鹼基要隨機分布，儘量均勻。
6、引物自身不能有連續4個鹼基的互補。
7、引物之間不能有連續4個鹼基的互補。
8、引物5『端可以修飾。
9、3』端不可修飾，而且要避開AT，GC富集的區域，避開T/C,A/G連續結構（2-3個）。
10、引物3'端要避開密碼子的第三位。
11、引物整體設計自由能分布5'端大於3『端。
12、定量產物長度80-150bp最好，最長是300bp。
原則忒多啦，小夥伴們，先別暈，看下方。
方法一：PrimerBank法
網址：
https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html
打開以上網址，進入PrimerBank網站界面，如下圖
個人覺得這是最便捷的引物獲取方法，該網站可以非常迅速地檢索到已經他人驗證的引物序列及相關反應條件。
圖中第一個方框，一般選擇NCBI Gene ID；第二個方框選擇你所關注的物種，常用的就是Mouse和Human了，如果為其它物種，則選擇All Species即可；第三個方框中需要輸入你關注的基因ID號碼。
如何獲取基因ID呢，這裡就需要打開NCBI網站，選擇Gene，並輸入你的目的基因如p53 homo，選擇第一個，可見其ID號為7157。如下圖所示。
然後將ID號7157輸入上方PrimerBank網站的For text框中，並選擇種屬為人，點擊Submit後，跳轉頁面如下。
網站會自動推薦3對已經驗證的引物，小夥伴們可以直接拿著用了。
方法二：Ensembl+NCBI BLAST法
很多人會推薦大家使用Oligo、PP或DNA man之類的，小編這裡想推薦一個更好用的網站，Ensembl，非常實用。
網址1：
http://asia.ensembl.org/index.html
網址2：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome
首先打開Ensembl網站，選擇物種為Human，檢索基因為BRCA2（其它物種可在左下方箭頭處尋找）。如下圖所示。
順手點擊Go，跳轉至以下界面。由於我們要拿到轉錄組的序列，所以需要進一步點擊左側的Transcript篩選框。
點擊轉錄組篩選框後，可見以下界面，我們可以選擇第一個。
繼續點進去，然後在左側選擇cDNA，點擊後如下圖所示。
然後點擊左側的Configure this page，跳轉界面中除了show exons勾選，其它全部不選擇，勾選完後點擊右上角的對勾符號。
選擇可轉錄為蛋白的序列，接著在頁面中下方可以看到該序列的詳細內容，不同顏色代表一個間隔的外顯子。任意選擇一對連續的不同顏色鹼基。複製到一個word中，並且標記不同的顏色(事實上，也可以下載一個完整的序列文件)。然後計數不同顏色鹼基的個數，下面會用到。
接著就是NCBI BLAST驗證過程了。打開上面提供的網站，按照下圖所示進行填寫，其它的默認就行。順手點擊頁面下方的Get Primers，跳轉後點擊All，點擊Sumit。
得到的序列如下方所示，大家可以自行選擇了。
完結！撒花！
This is the dividing line.
以上為本期內容，引物設計。
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