小白qPCR掃盲和2個超讚的在線引物設計網站介紹!

2021-02-20 醫學方

實時螢光定量PCR作為實驗室最常用的實驗。研究基因在mRNA表達水平,以及驗證基因敲除後下遊靶基因變化情況等等。

首先，實時螢光定量PCR是一種在DNA擴增反應中，以螢光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環後產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。

最常用的方法有SYBRGreenⅠ與 TaqMan探針法。下面介紹一下原理：

在PCR反應體系中，加入過量SYBR螢光染料，SYBR螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。

探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收；當PCR擴增時，Taq酶的5』-3』外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號。因此他每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。

在進行實時螢光定量PCR引物設計之前，大家都應該了解引物設計需要注意的一些細節與原則.

下面介紹兩個在線設計實時螢光定量PCR引物的網站，不用安裝軟體，直接上網就可搞定。

   

網址：https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

1.首先進入網站主頁，選擇Keyword, 根據自己需求選擇種屬以及基因名稱。

2.點擊 submit 後可以看到以下界面，網站會推薦多對引物，可以根據引物長度、Tm值選擇。

網址;http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi

1. 在 PUBMED 獲得基因序列後，在 primer3plus 主頁上輸入基因序列。

2. 點擊general setting, 設置引物擴增長度，一般可設置擴增長度偏大一些，然後根據推薦引物選取合適擴增長度。

3. 點擊pick primers後，首先會看到優選推薦的一對引物，同時在序列中看到引物所在位置。Primer3plus 網站中可以看到引物 Tm 值以及 GC含量。

最好在NCBI的BLAST裡檢驗一下引物的特異性，再交給公司合成。

1. 進入 pubmed 主頁，點擊 BLAST 中 Nucleotide Blast。

3. 網頁打開後，會看到如下界面，不同顏色代表對引物序列的評分，一般會選擇40分以上，即至少藍色。繼續下拉網頁會看到序列詳細信息，物種分類、基因名稱以及序列位置。

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