一文搞懂引物設計

引物設計原則

作為一個科研狗，日常實驗中經常會遇到引物設計，毫無疑問，一對好的引物對實驗結果很重要。在設計引物前，我們首先了解一下引物設計的原則，總結為以下7點：

1. 要設計引物首先要找到DNA 序列的保守區。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。如這個區域單鏈能形成二級結構，就要避開它。

2. 引物長度一般在15～30鹼基之間，因為過長會導致其延伸溫度大於 74℃，不適於 TaqDNA 聚合酶進行反應。同時，G＋C 含量在40％～60％之間，過高或過低都不利於引發反應，而且兩條引物之間GC含量不能相差過大。

3. 為了避免引物形成二級結構以及引物之間形成二聚體，引物自身不能有連續4個鹼基的互補。引物之間不能有連續4個鹼基的互補。

4. 引物 3』端的末位鹼基對 Taq 酶的 DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位鹼基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位鹼基為A 的錯配效率明顯高於其他3個鹼基，因此應當避免在引物的3』端使用鹼基A。

5. 引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結構的可能以免影響擴增。不過引物的5′端可以修飾。

6. 引物所對應模板位置序列的Tm值在55℃～80℃之間。Tm 值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)。

 

引物設計方法

下面開始介紹設計引物的方法, 總結為以下五種：

1）NCBI在線設計；

2）引物合成公司在線設計；如：

Origene公司，http://www.origene.com.cn/qPCR/primers.aspx；

生工，https://www.sangon.com/newPrimerDesign；

3）Primer 引物設計軟體；

4）引物資料庫（如Primerbankhttps://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）；

5）查詢相關文獻（建議參考高分的文獻）。

 

1） NCBI在線設計

1. 打開NCBI官網（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），將搜索資料庫改為「Gene」，以白介素6為例：

2. 在新打開的頁面中找到 「NCBI Reference Sequences (RefSeq)」，進入序列頁面：

IL-6的cDNA序列，紅色部分為編碼區域。

3. 再點擊頁面右側的「Pick Primers」：

4. 再點擊」get primers」：

即可獲得引物，網站一般給出十條： 

2）引物合成公司在線設計

① 通過上海生工網站進行設計

首先需要去NCBI上找到基因的參考序列，將序列輸入網站，並選擇引物用於具體哪個實驗以及物種等，最後點擊提交即可得到引物序列。

② 通過Origene公司設計

輸入需要設計引物的基因名並選擇物種，點擊「GO」，網站就會顯示出一條序列，值得注意的是，這條序列都是經過驗證的通用序列。由於該公司合成引物價格太貴，因此不推薦大家選擇這個公司去合成，但是可以使用它們的序列。 

3）通過Primer Premier引物設計軟體進行設計

首先將要設計的基因的參考序列複製進去，再點擊設計引物，軟體會自動設計出一條引物，再單擊「AllPrimers」，軟體就會顯示出所有的引物序列，包括引物序列的各項特徵。 

4）通過引物資料庫，例如primer bank

需要注意的是，這個網址輸入的是基因的NCBI編號或者GI號，這些在NCBI上面都可以查到，不能直接輸入基因名。輸入後點擊「Submit」即可獲得引物。 

5）通過查詢相關文獻，建議通過谷歌學術

總結

在具體設計引物的時候，推薦大家優先使用高分文獻中使用的序列，因為已經經過驗證，一般來說不會有什麼問題。其次，可以使用Origene這個公司網站進行設計，這個公司只會給你一條序列，但是給出來的一般都是通用的，所以問題也不大。但是對於一些不常見的基因，可能在谷歌學術裡面搜不到相關文獻，這時候就推薦使用NCBI或者Primer Premier軟體進行設計，值得注意的是，由於使用Primer Premier軟體進行設計輸入的是基因的參考序列，所以設計出來的引物都是沒有經過Blast驗證的，進一步的話需要去NCBI進行primer blast以驗證引物特異性。

關於引物設計方法就介紹到這裡了。最後，祝大家實驗順利！

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