利用PCR技術擴增抗體VH和VL基因,所獲得的產物需要滿足以下兩個要求：首先,得到的產物必需是正確的目的基因,要有可靠性;其次,要獲得儘可能多種類目的基因,即有多樣性。因此,設計出合理的擴增引物十分重要。
哺乳動物功能性抗體基因是由種系基因在DNA水平上重排產生的。以小鼠的抗體重鏈為例,VH基因由V、D、J三部分構成。在小鼠第12號染色體上,大約有300種V基因、12種D基因、4種J基因,在B細胞發育過程中,發生基因重排,由其中一個V、D、J共同組成一個VH,這樣在一個動物個體中可能的VH至少有15,000種。如果考慮到重排過程中在D區和J區連接處產生的多種變化,這一數字是大大地保守了。小鼠的VL基因是通過V-J重排產生的,估計其多樣性至少有2,000種。
當前PCR引物設計所依據的數據主要來自已發表的抗體可變區基因序列文獻,包括Kabat等人編寫的《Sequence of Proteins of Immunological Interests》(1991),EMBL Database,Genbank Database。由於抗體基因編碼FR區的部分比編碼CDR區的部分要保守,因此可以將引物設計為FR區的互補序列。針對抗體不同亞族其FR區序列也不盡相同的特點,本室設計了一組引物以確保不會漏掉某一亞族。選擇與FR1區段互補的序列作為5』端引物,選擇與FR4互補的序列作為3』端引物(表12-1)。擴增的產物是VH或VL基因。為了便於基因克隆,還在引物外側加上了合適的酶切位點,重鏈是XhoI-SpeI,輕鏈是XbaI-EcoRI。這些酶所識別的序列經計算機檢索,證明很少或幾乎不在抗體可變區基因內出現。在酶切位點外側有至少兩個保護鹼基,通常是CC或GG,以便提高內切酶的切割效率。保護鹼基越多,越利於提高限制酶切的效率,但是成本也會提高。
(1)引物長度一般介於17～35鹼基之間,一般以20～28個鹼基為宜,這不包括額外的內切酶識別序列和外側的保護鹼基。
(2)四種鹼基在引物內的分布應儘量隨機,GC含量應為大約50%。
(3)避免引物內出現多聚嘌呤或多聚嘧啶。
(4)檢查5』與3』引物之間或內部是否有相互配對的情況。
(5)避免使用有明顯二級結構的序列,尤其是在引物3』端。
(6)在引物5』端允許少量與模板不配對的鹼基存在,但在3』端的序列應與模板互補。
(7)防止引物中出現一切可能影響正常轉錄和翻譯過程的序列。
目前國內外已開發出多種PCR引物設計軟體,使引物設計更加方便、快速、準確、合理。引物設計完成後即可用DNA合成儀合成,引物使用前用OPC柱、HPLC或PAGE純化。
利用所設計的引物,已成功地從多種雜交瘤中擴增出特異的抗體可變區基因,充分表明這套引物是成功、合理的。