抗體工業領域，雜交瘤技術和噬菌體展示抗體庫技術仍是當前最主要的兩項抗體發現技術，兩種技術則各有千秋。
抗體發現（Antibody Discovery）是在生產工藝開發階段之前的工作。本文榮幸地邀請了艾柏森謝總經理謝朋輝老師就當前主要的抗體發現技術做一個簡單介紹。
抗體發現：雜交瘤技術和噬菌體展示抗體庫技術
雜交瘤技術產生，發展和應用
雜交瘤技術產生於1975年，是整個生命科學發展的一個重要裡程碑，為此獲得了1984年諾貝爾生理和醫學獎。雜交瘤技術的科學原理和設計非常巧妙。B細胞可以分泌表達抗體，一個B細胞克隆產生一種抗體，即單克隆抗體。但是由於B細胞是一種原代細胞，在體外不能無限傳代，所以人們無法在體外有效篩選和生產單克隆抗體。當時，抗體基因克隆、噬菌體展示抗體庫和哺乳動物細胞表達抗體等基因工程技術尚未出現，人們迫切需要一種技術，為疾病的診斷和治療提供單抗產品。
骨髓瘤細胞是一種永久傳代的腫瘤細胞，也來源於B細胞。英國的兩位偉大的科學家科赫（Kohler）和米爾斯坦(Milstein)，採用仙臺病毒作為促細胞融合劑，將小鼠骨髓瘤細胞和小鼠B細胞體外融合，產生出多種同源或異源二倍體或多倍體子代細胞，以及未經融合的親本細胞。這些細胞中只有異源雜合細胞才能在HAT選擇培養基中生存下來，其他細胞在幾天後均會死亡。這些異源雜合細胞被稱為雜交瘤細胞。這些雜交瘤細胞還可以接種在動物腹腔中產生腹水，這是一種非常簡單的抗體生產方式。
即使現在看，HAT選擇培養基設計之巧妙也是非常令人讚嘆的。細胞DNA合成主要途徑必需葉酸作為關鍵輔酶，次要途徑則必需次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在，而且需要次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。HAT培養基中含有次黃嘌呤(hypoxanthine，H)、甲氨蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)三種成分。甲氨蝶呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷細胞利用正常途徑合成DNA。HGPRT陽性細胞會在利用8-AG合成毒性核苷酸之後死亡，經毒性藥物8-氮鳥嘌呤（8-AG）篩選出來的HGPRT陰性骨髓瘤細胞株被用於製備雜交瘤細胞。正常的B細胞是HGPRT陽性細胞，所以融合後在HAT選擇培養基中，HGPRT陰性的親本骨髓瘤細胞和其同源二倍體或多倍體子代細胞，因無法合成DNA而死亡；親本B細胞和其同源二倍體或多倍體子代細胞則是原代細胞，生長几代之後也會死亡。由於傳代過程中遺傳物資分配不均一，異源多倍體細胞也會死亡。這樣，存活下來的細胞大多數是異源二倍體細胞，即雜交瘤細胞。
HAT篩選原理
在此原理基礎上，雜交瘤技術又經過不斷的改進。目前主要採用PEG(聚乙二醇)作為促融合劑製備雜交瘤細胞，該方法更為有效和穩定。為了提高融合效率，科學家又開發了電融合技術。所謂電融合技術，即通過高頻交流電場將B細胞和骨髓瘤細胞有規律的排列在一起，然後施以短暫的高壓方波脈衝，穿透細胞膜，依次導致細胞膜融合、細胞質融合和細胞核融合，製備出雜交瘤細胞。而電融合的效率一般是PEG融合的10倍以上。
從動物選擇上看，最初雜交瘤技術是製備大鼠和小鼠雜交瘤細胞，主要是因為獲得了穩定和高效的大鼠和小鼠的骨髓瘤細胞適合用於雜交瘤製備。後來，人們又陸續開發了合適的兔骨髓瘤細胞和人骨髓瘤細胞。但由於骨髓瘤細胞的智慧財產權、融合穩定性，以及倫理因素（人雜交瘤）等原因，兔雜交瘤技術和人雜交瘤技術沒有被廣泛推廣。
雜交瘤技術的產生極大促進了單克隆抗體產品的開發。在現代科學研究、疾病診斷和治療和工業生產等多個領域，單克隆抗體和其相關產品都具有不可替代的作用。即使基因工程抗體技術發展非常成熟的今天，雜交瘤技術仍然具有不可替代的作用。
噬菌體展示抗體庫技術
上世紀80年代末，噬菌體展示技術、PCR技術和基因工程抗體技術相結合，產生了噬菌體展示抗體庫技術。
將全套抗體重鏈和輕鏈基因分別克隆出來，再以單鏈抗體（scFv）、單域抗體（VH或VL）或Fab抗體的分子形式，與噬菌體顆粒的結構蛋白（主要是P3蛋白）融合表達，並展示在噬菌體顆粒的表面。
由於在噬菌體顆粒的表面展示抗體，內部含有抗體基因，所以完成了功能表型和基因型的偶聯或統一，進而允許採用親和淘選的方式，通過抗原和抗體特異結合這一表型篩選獲得抗體基因。由於構建抗體庫的基因來源於混合後B淋巴細胞的裂解物，所以不同B細胞克隆的重鏈和輕鏈基因又發生了組合配對，因此又稱為組合抗體庫技術。
噬菌體抗體庫篩選示意
在噬菌體展示技術的基礎上，後來又產生了以核糖體展示為代表的體外展示技術，以酵母展示為代表的細胞表面展示技術，這些技術也主要被用於抗體庫的構建和篩選。這些技術改變的是基因型和表型的偶聯方式，沒有改變組合抗體庫這一本質特徵。混合單細胞抗體基因擴增技術和原位抗體片段基因製備技術結合，才能真正構建天然配對抗體庫，但目前天然配對抗體庫技術尚未成熟。
各有千秋
抗體工業領域，雜交瘤技術和噬菌體展示抗體庫技術仍是當前最主要的兩項抗體發現技術。兩種技術則各有優勢和劣勢。
雜交瘤技術的優勢在於：
（1）小鼠或大鼠易於飼養和免疫。有效免疫是篩選高親和力抗體的保障，雜交瘤和小鼠/大鼠免疫抗體庫是獲得高活性小鼠抗體的有效手段。
（2）由於細胞融合操作簡單而且穩定，僅需要細胞培養知識及技術和試驗條件，無需分子生物學相關技術和條件，就可以獲得單克隆抗體。以開發科研或診斷用單克隆抗體為目的時，門檻相對較低，更易於推廣和普及。
（3）將小鼠雜交瘤細胞輸入到小鼠腹腔內，就可以生產單克隆抗體，方式非常簡單，也非常有利於開發科研或診斷用單克隆抗體。當然，現在對科研或診斷抗體的生產也在逐步要求體外細胞培養生產，以保證無動物源成分。這就要求克隆雜交瘤抗體的基因，並採用哺乳動物細胞表達系統來生產重組單克隆抗體。
（4）噬菌體展示抗體庫採用大腸桿菌作為表達宿主，採用單鏈抗體（scFv）、單域抗體（VHH）或Fab抗體等非天然抗體分子形式。抗體的結構和功能遠不如哺乳動物細胞表達的抗體產品。在實踐中，抗體產品的分子形式主要是哺乳動物細胞表達生產的IgG。噬菌體展示抗體庫篩選的抗體在分子轉換成IgG之後，即使採用哺乳動物細胞表達生產，也會出現部分克隆活性降低和丟失的現象。而雜交瘤細胞就是一種哺乳動物細胞，其分泌的單克隆抗體是天然的IgG分子形式。因此雜交瘤單克隆抗體產品穩定，無需分子改造，可以直接應用於除疾病治療之外的大多數領域，而且在篩選過程中，即使在小鼠IgG和人IgG之間分子轉換，也很少出現活性降低和丟失的現象。
（5）雜交瘤單克隆抗體的重鏈和輕鏈是原始B細胞的天然配對。從組合抗體庫中篩選的非天然配可能影響抗體的活性和穩定性。
與噬菌體展示抗體庫技術相比，雜交瘤技術的劣勢主要體現在：
（1）針對動物毒性抗原、自身抗原、免疫耐受原和弱免疫原性抗原，由於無法產生有效免疫，故而不適合採用雜交瘤技術來製備抗體。可以採用通用天然抗體庫、合成或半合抗體庫篩選這類抗原的抗體。
（2）細胞融合後，產生的候選克隆數量少。即使採用電融合技術，候選克隆一般最多達到10^4個，而抗體庫的容量可以達到10^10以上。同等免疫條件下，候選克隆越多，越容易篩選出高活性抗體。
（3）作為異源雜合二倍體細胞，候選雜交瘤克隆需要亞克隆後才能穩定。不及時亞克隆的候選雜交瘤細胞不穩定，容易丟失陽性克隆。而挑選陽性克隆，尤其是複雜的功能篩選，需要一定的時間窗口，窗口越長，功能篩選越成熟和可信。微量凍存候選克隆可以延長功能篩選時間窗口，但功能檢測需要足夠量的抗體蛋白，因此批量亞克隆仍然需要大的工作量。
雜交瘤篩選失敗後的應對方案是重新免疫或者重新融合（也受限於免疫後小鼠的飼養周期），必然產生時間成本。相比而言，抗體庫一旦建成，就可以無限期保存。篩選時僅需取出少部分噬菌體顆粒，原始噬菌體庫就足以應付反覆篩選，無需重新建庫。此外，親和淘選的方式既可以特異性富集結合抗原的抗體，還可以儘量扣除與對照蛋白結合的抗體，有效提高篩選效率。抗體庫親和篩選結合大規模測序技術還可以充分擴大篩選規模。
（4）抗體的重鏈和輕鏈重新組合配對，也可能優化抗體性能，這也是組合抗體庫的一個優勢。
（5）出於倫理考慮，限制了人雜交瘤技術的發展和應用。通常雜交瘤單克隆抗體是動物抗體，用於開發藥物必需將抗體進行人源化改造。
對免疫轉基因人源化小鼠，也可以採用雜交瘤技術製備全人源抗體。但是轉基因人源化小鼠技術具有較高的技術和很強專利門檻，目前為止還無法推廣。
相比而言，全人源抗體庫則允許直接篩選全人源抗體，無需人源化，而全人源抗體目前是抗體藥物開發的優選。
（6）抗體庫是一項基因工程技術，雜交瘤是一項細胞工程技術，因此可以利用現代分子生物學知識和技術，構建雞、兔、駱駝、羊駝、鯊魚等動物的免疫抗體庫，解決因無可用骨髓瘤細胞而無法製備此類動物雜交瘤單克隆抗體的難題。
未來趨勢
結合雜交瘤技術的原理和特點，不難理出其發展趨勢。
首先，可以肯定仍然聚焦小鼠/大鼠雜交瘤領域。隨著轉基因人源化小鼠（或大鼠）技術的推廣，利用雜交瘤技術篩選全人源抗體將進一步發展。
其次，免疫仍是成功篩選雜交瘤單抗的關鍵。尤其是複雜膜蛋白免疫和打破免疫耐受等技術難題將會是攻關的重點。
最後，應用高通量克隆挑選及鑑定技術和設備，擴大篩選規模，也是以金錢換時間的策略，在抗體藥物開發領域還會不斷推陳出新。微量凍存候選克隆、快速單細胞克隆抗體基因和高通量表達和純化重組抗體等技術的積累和突破，結合先進設備的使用，是發展趨勢之一。
總之，將抗體篩選與抗體應用緊密聯繫在一起，會是未來雜交瘤技術發展的最基本考量。
Q&A
1.雜交瘤技術篩選抗體的難點主要在哪裡，比如是在篩選的通量嗎？企業和研究者應該如何選擇高通量篩選的設備和方法呢？
企業和研究者首先需要解決高效免疫和高效融合技術難題，這是基礎。
然後採用有限稀釋，可結合自動化移液工作站，或採用其他方法（流式，自動克隆挑取等）做克隆化培養，再建立高通量蛋白結合檢測方法（ELISA, SPR），高通量細胞結合檢測方法(流式或多重螢光檢測等)，來挑選目標克隆。也可以採用一些新近出現的微流控或細胞光導系統做整合平臺。
企業可綜合考慮內部能力和項目情況選擇適合的方法和設備，也應避免昂貴的設備長期閒置造成的浪費，這種現象在我和師兄（編者註：拓澳生物員工）聊起時，發現相當普遍。就我自己的例子而言，每年也都有一些雜交瘤的項目，目前用一些常規的設備基本足以應付。
2.通過雜交瘤，噬菌體展示或其他抗體發現技術找到分子之後，接下來的工作流程大概是怎樣的？
抗體優化，即人源化，親和力成熟，去除T細胞表位等；抗體鑑定，親和力測定，表位鑑定，體外和體內功能檢測和鑑定等。
抗體製備，建立穩定細胞株，建立生產工藝，中試生產等。
臨床前試驗，藥理，毒理藥代等。
可參考下圖的大致流程。
生物藥研發到生產的大致流程示意。圖片來源：丁香園
3.外源基因轉染到工程細胞如CHO細胞後，對轉染pool的細胞進行分離篩選和建株，此時監管部門要求提供單克隆源性（monoclonality）的證據，請問此時的情況和雜交瘤細胞分離時有什麼不同？
首先不要混淆兩個不同的工作階段和目的。抗體發現是找到有功能的抗體的序列，用於後續的抗體優化直至得到外源基因（GOI),此時沒有監管部門要求提供雜交瘤的「克隆源性」；細胞株開發則已進入CMC階段，將得到的外源基因轉染到工程細胞中，篩選和建立穩定高效表達的細胞株用於未來生產，此時監管部門要求必須提供細胞株的單克隆源性證據。
在雜交瘤篩選候選抗體時，如果雜交瘤細胞株不是單克隆，或者骨髓瘤細胞中還有其他重鏈或輕鏈基因，在克隆抗體基因之後需要重新組合配對各個重鏈和輕鏈，表達重組抗體進行驗證。
在鑑定雜交瘤抗體活性的過程中，需要儘量及早亞克隆，否則細胞上清中的抗體分泌量降低，影響抗體鑑定。為了長期保存雜交瘤細胞株和利用小鼠腹水法或體外培養法生產抗體，也需要篩選到穩定的單克隆。因為多克隆雜交瘤細胞在擴增過程中，抗體的分泌量會降低。
上圖局部示意：抗體發現（Antibody Discovery）和細胞株開發（Cell Line Development）是不同階段的工作，其各自的目的和要求不同。