利用CRISPR/HDR技術進行工程化改造有望賦予雜交瘤抗體多樣化的功能!

2021-01-09 生物谷

2019年9月30日 訊 /生物谷BIOON/ --如今，生物工程師和生命科學家能夠結合雜交瘤技術來製造大量相同的抗體，同時還能開發出新型的抗體療法和診斷技術，近年來該技術的臨床前和臨床研究都突出了抗體型別對於治療效果的重要性。在一項最新研究中，來自荷蘭的研究人員開發出了一種多用途的CRISPR和同源定向修復（HDR）平臺，其能夠快速設計免疫球蛋白結構域並形成重組雜交瘤，其能夠分泌設計抗體的首選格式、物種或亞型。研究人員認為，這種通用型的平臺或將能夠促進大規模抗體工程研究，助力科學家們進行臨床前的抗體研究工作。

圖片來源：Science Advances,doi:10.1126/sciadv.aaw1822

單克隆抗體（mAb）的應用徹底改變了醫學領域，其能用來治療曾經科學家認為無法治癒的多種疾病。從1975年開始，雜交瘤技術被廣泛應用於單克隆抗體的發現、篩選和生產，在過去10年裡，科學家們為臨床研究製造了大量雜交瘤，並對其進行了驗證和發展，其中mAb的形式和型別對於理解其在臨床前模型中的表現非常重要。基因工程所產生的mAbs通常採用重組技術進行生產，其中的可變結構域能進行測序、並且克隆到質粒中，在瞬態系統中進行表達；但這些過程比較耗時、具有挑戰性且成本高昂，會嚴重阻礙臨床前的研究進程。

當前研究中，研究人員使用一步式的CRISPR/同源性定向修復技術對雜交瘤進行了工程化修飾，隨後其迅速產生了重組雜交瘤，分泌Fc格式的單克隆抗體，且能夠自由插入首選標籤或插入突變。研究人員製造出了能產生片段抗原結合（Fab）的雜交瘤，即通常與抗原結合的抗體位點，其C端帶有位點特異性化學酶修飾和純化的標記，研究者所製造出的雜交瘤能夠分泌同型和既定種類的嵌合抗體，同時還能產生並不損害抗原特異性的Fc突變抗體。

隨後研究人員從雜交瘤上清液中分離出了工程化的抗體，從而就能夠在體內和體外來觀察其預期的生化和免疫學特徵，由於研究者的目標是靶向作用免疫球蛋白基因座的恆定結構域，因此CRISPR/HDR的方法能夠適用於任何物種或同種型的雜交瘤。此前研究人員利用Fab片段來治療特定的自身免疫性疾病，靶向作用不同的治療性納米藥物並產生雙特異性抗體，在獲得Fab片段的常規技術中，科學家們無法為基因組安裝有用的標籤或突變，為了在當前工作中使用CRISPR/HDR來獲得Fab分泌型雜交瘤，研究人員選擇雜交瘤克隆NLDC-145來作為第一個靶點，其能夠分泌特定的mAbs的，為了靶向作用克隆的重鏈基因座，研究者利用優化的引導RNA來指導Cas9蛋白質目標鉸鏈區並產生雙鏈斷裂。為了修復雙鏈斷裂，研究人員設計出了一種HDR結構並插入了感興趣的靶點，由於HDR的功率通常較低，因此研究人員豐富了含有含有供體構建物的細胞的能力，隨後他們使用PCR技術鑑定了供體構建體的插入，從而確定了供體構建體能夠整合到正確的基因組位置。

一周後，研究人員獲得了單克隆細胞懸液，並使用上清液來確定分泌產物的抗原特異性和表型，在流式細胞儀的幫助下，研究人員觀察到了大部分單克隆雜交瘤進行了成功地基因改造，並通過蛋白印跡分析驗證了相應的結果，從而堅定了目標抗體產物或蛋白質。在成功形成充足雜交瘤從而產生Fab片段後，研究人員使用相同的策略開發了免疫腫瘤學中所使用的雜交瘤。在建立並驗證雜交瘤CRISPR/HDR基因組工程學手段後，研究人員對同型轉換的mAbs的功能或生物學特性進行表徵分析，隨後他們進行了測定以確定抗體-受體之間的相互作用，根據其觀察到的激活和抑制受體的能力，研究者預測了CRISPR工程化mAbs引起的抗體依賴性細胞毒性能力，未來完成表徵研究，研究人員在體內和體外測試了抗體在誘導抗體依賴性細胞毒性上的潛力。

圖片來源：Science Advances,doi:10.1126/sciadv.aaw1822

在實驗室中，研究者利用鼠結腸腺癌細胞（MC38）來促進顆粒的吞噬作用，同時還會表現出MIH Fc突變體與全血之間的相互作用，在體內實驗中，研究者測試了MIH Fc突變體剔除B細胞的能力。隨後研究者對小鼠實施安樂死，並使用流式細胞儀和免疫螢光成像技術分離了小鼠的脾臟來確定B細胞的耗竭情況，體內和體外實驗均得到了相似的結果，研究結果表明，使用CRISPR/HDR設計的嵌合和突變mAbs與天然和重組對應物具有相同的生化和免疫因子特性。

研究人員利用上述方法開發了一種多功能平臺，其能從親本雜交瘤開始輕鬆快速產生Fc工程抗體，研究者使用一步CRISPR/HDR方法就能夠獲得雜交瘤，並在21天時間內產生1）單價Fab片段；2）來自外來物種的Fc同型突變體；3）沒有效應子功能的Fc沉默突變體。這種方法包括用於純化和位點特異性綴合的有用蛋白標籤，同時該技術還能用於任何實驗室進行雜交瘤細胞培養。

最後研究者表示，由於雜交瘤產品主要用於體內臨床前研究，因此該方法未來或將有助於臨床抗體的研究及幫助開發治療性抗體，工程抗體產品的位點特異性功能化將會廣泛應用於生物醫學工程、化學生物學、藥物開發和納米醫學等領域。（生物谷Bioon.com）

參考資料：

【1】Johan M. S. van der Schoot， Felix L. Fennemann， Michael Valente，et al. Functional diversification of hybridoma-produced antibodies by CRISPR/HDR genomic engineering， Science Advances  28 Aug 2019： Vol. 5， no. 8， eaaw1822 DOI： 10.1126/sciadv.aaw1822

【2】Antibodies to watch in 2018

【3】G.KOHLER & C. MILSTEIN. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity， Nature volume 256， pages495–497 (1975) doi：10.1038/256495a0

【4】Martin Jinek， Krzysztof Chylinski， Ines Fonfara， et al. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity， Science  17 Aug 2012： Vol. 337， Issue 6096， pp. 816-821 DOI：10.1126/science.1225829

【5】Genome engineering with CRISPR/HDR to diversify the functions of hybridoma-produced antibodies

by Thamarasee Jeewandara， Science X Network， Phys.org

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