腫瘤治療之雙特異性抗體—結構、優勢、製備、研究現狀

1、雙特性抗體簡介

雙特異性抗體（BsAb）又稱雙功能抗體，可同時識別和結合兩種不同的抗原和表位，並阻斷兩種不同的信號通路以發揮其作用。根據不同結構可將雙特異性抗體結構主要有2大類：含Fc片段的雙特異性抗體（IgG-like雙特異性抗體）與不含Fc片段的雙特異性抗體（non-IgG-like雙特異性抗體）。

IgG-like雙特異性抗體：IgG樣BsAb有Fc部分，具有Fc介導的效應功能，如抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（ADCC）、補體依賴的細胞毒作用（CDC）和抗體依賴的細胞介導的細胞吞噬作用（ADCP）。分子量相對較大，其Fc部分有助於抗體後期的純化並提高其溶解性、穩定性。IgG樣BsAb相對分子量較大，且Fc部分與受體FcRn結合，增加了抗體血清半衰期。此類抗體結構主要包括Triomabs/quadroma、DVD-Ig（dual variable domain Ig）、CrossMAb、Two-in-one IgG、scFv2-Fc。

雙特異性抗體（BsAb）又稱雙功能抗體，可同時識別和結合兩種不同的抗原和表位，並阻斷兩種不同的信號通路以發揮其作用。根據不同結構可將雙特異性抗體結構主要有2大類：含Fc片段的雙特異性抗體（IgG-like雙特異性抗體）與不含Fc片段的雙特異性抗體（non-IgG-like雙特異性抗體）。

non-IgG-like雙特異性抗體：非IgG樣BsAb缺乏Fc片段，僅通過抗原結合力發揮治療作用，具有較低的免疫原性、易於生產、分子量小等特點。因相對分子量較小，其在腫瘤組織的滲透性較高，因此具有更強的治療效果。這些BsAb有諸多形式，主要包括TandAb（tandem diabody）、scFv-HSA-scFv、BiTE（bi-specific T-cell engager）、DART（dual affinity retargeting）、Nanobody。

2、雙特異性抗體的臨床優勢

BsAb與普通抗體相比增加了一個特異性抗原結合位點，在治療方面表現出了以下優勢：

√ 介導免疫細胞對腫瘤的殺傷：雙特異性抗體的一個重要作用機制是介導免疫細胞殺傷，雙特異性抗體有兩條抗原結合臂，其中一條與靶抗原結合，另一條與效應細胞上的標記抗原結合，後者可以激活效應細胞，使其靶向殺傷腫瘤細胞。目前已經批准上市的2個雙特異性抗體產品都屬於這個類別，Trion Pharma公司開發的catumaxomab能夠靶向腫瘤表面抗原EpCAM和T細胞表面受體CD3，而Micromet公司和Amgen公司開發的Blinatumomab可以同時結合CD19和CD3。兩者都是通過激活並召集殺傷性T細胞，從而達到治療腫瘤的目的；

√ 雙靶點信號阻斷，發揮獨特的或重疊的功能，有效防止耐藥：同時結合雙靶點，阻斷雙信號通路是雙特異性抗體的另一個重要作用機制。受體絡氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTKs）是最大的一類酶聯受體，在細胞增殖過程中發揮重要的調節作用，如Her家族等。RTKs在腫瘤細胞表面異常高表達，導致腫瘤細胞惡性增生，因此也是腫瘤治療的重要靶點。針對RTKs的單靶點單克隆抗體已在腫瘤治療中得到廣泛應用，但是，腫瘤細胞可以通過轉換信號通路或通過HER家族成員自身或不同成員之間的同源或異源二聚體激活細胞內信號進行免疫逃逸。因此採用雙特異性抗體藥物同時阻斷兩個或多個RTKs或其配體，可以減少腫瘤細胞逃逸，提高治療效果；

√ 具備更強特異性、靶向性和降低脫靶毒性：利用雙特異性抗體兩個抗原結合臂可以結合不同抗原的特點，兩個抗原結合臂分別結合癌細胞表面2種抗原，可以有效增強抗體對癌細胞的結合特異性和靶向性，降低脫靶等副作用；

√ 有效降低治療成本：以BiTE為例，與傳統抗體相比在組織滲透率、殺傷腫瘤細胞效率、脫靶率和臨床適應症等指標方面都具有較強的競爭力，臨床優勢顯著。特別在使用劑量方面，由於其治療效果可以達到普通抗體的100-1000倍，使用劑量最低可將為原來的1/2000，顯著降低藥物治療成本。相對於組合療法，雙特異性抗體的成本也遠遠低於兩個單藥聯合治療。

雙特異性抗體的製備主要有雙雜交瘤細胞法，化學偶聯，重組基因製備等方法。重組DNA技術是目前製備BsAb使用最多的技術。

3、雙特異性抗體的製備方法

雙特異性抗體的製備主要有雙雜交瘤細胞法，化學偶聯，重組基因製備等方法。重組DNA技術是目前製備BsAb使用最多的技術。

√ 化學偶聯法：該方法最早出現於上世紀80年代，其原理是通過化學偶聯劑（如鄰苯二馬來醯亞胺、N-琥珀醯-3-（2-吡啶二硫基）丙酸鹽、二硫代醯基苯甲酸等）將兩個完整IgG或兩個F(ab)2抗體片段偶聯成一種BsAb，這種方法快速簡便，但是容易破壞抗原結合部位從而影響抗體活性，同時交聯劑本身的安全性和致癌性不確定；

√ 雙雜交瘤融合法：通過細胞融合的方法將2株不同的雜交瘤細胞融合成雙雜交瘤細胞株，然後通過常規的雜交瘤篩選法克隆靶細胞。由於雙雜交瘤的遺傳背景來源於親代的兩種雜交瘤細胞，它必然要產生2種重鏈和2種輕鏈分子，而這些輕重鏈的隨機組合配對方式才能產生所需的BsAb.利用雙雜交瘤方法製備雙特異性抗體隨機性較大，效率低，但是BsAb生物活性較好，抗體結構比較穩定。利用Konck-in-hole技術可以有效解決異源抗體抗體重鏈正確配對的難題。製備方法是將一個抗體的重鏈CH3區366位體積較小的蘇氨酸突變為體積較大的絡氨酸，形成突出的「杵」型結構；將另一個抗體重鏈CH3區407位較大的絡氨酸殘基突變成較小的蘇氨酸，形成凹陷的「臼」型結構；利用「杵臼」結構的空間位阻效應實現兩種不同抗體重鏈間的正確裝配。化學偶聯法和雙雜交瘤融合法生產出的雙特異性抗體為鼠源性，具有較強的免疫原性，且產量低純度差，在臨床應用上有很大的制約；

√ 基因工程：利用基因工程技術製備雙特異性抗體是目前最常用的製備方法，其製備原理為利用基因工程技術對傳統抗體進行基因工程方面的改造，從而形成多種形式的雙特性抗體。

4、雙特性抗體在腫瘤治療中的研發現狀

Catumaxomab

Catumaxomab（Removab，Trion）於2009年正式獲得EMA批准在歐洲上市，用於治療惡性腹水（腹腔轉移癌晚期患者常見的一種併發症），成為全球第一個上市的雙特異性抗體。在II / III期研究中，腹膜內catumaxomab改善了無穿刺存活率和下次腹腔穿刺的中位時間，減少了腹水的體徵和症狀，並顯示出改善OS的趨勢。 最常見的不良反應是發熱，噁心，嘔吐和腹痛。目前正在進行的臨床試驗包括卵巢癌、胃癌和上皮癌。Catumaxomab是一個分子量在150kDa三功能的抗體，由一個靶向腫瘤EpCAM的小鼠IgG2a和一個靶向CD3ε的大鼠IgG2b構成，同時還能通過Fcγ受體激活單核細胞、巨噬細胞、星狀細胞以及NK細胞。由於小鼠和大鼠的輕重鏈之間很少發生錯配，通過quadroma（hybrid-hybridoma）的方式，將分別表達小鼠和大鼠抗體的雜交瘤進行二次融合，從而得到同事分泌Triomab雙特異性抗體以及小鼠和大鼠單克隆抗體的雜交瘤細胞株。然後在通過親和力純化的方式、分別去除小鼠和大鼠單克隆抗體。雖然Catumaxomab是第一個批准上市的雙特異性抗體，但同時也具有非常明顯的局限性，主要體現在Triomab抗體複雜的生產工藝以及異源抗體比較容易產生的免疫原性問題。

Blinatumomab（博納吐單抗）

Blinatumomab於2014年12月4日獲得美國FDA批准，用於治療費氏染色體陰性的前體B細胞急性淋巴細胞白血病。Blinatumomab由Micromet公司（後被Amgen公司收購）開發，是利用DNA重組技術製備的一種雙特異性的單鏈抗體BiTE，通過一條多肽鏈把靶向腫瘤細胞和T細胞表面抗原的兩種單克隆抗體的可變區連接起來，Blinatumomab選擇性地靶向B細胞表面抗原CD19，同時特異性地結合T細胞表面抗原CD3從而激活T細胞。因為主要由兩條單鏈抗體連接而成，BiTE的分子量較小（55-60kDa），容易滲透腫瘤組織。同時BiTE缺乏Fc段因而免疫源性較低。臨床試驗已經證明Blinatumomab即便在很低的使用劑量下，依然可以有效召集T細胞並清除腫瘤，顯著改善復發或難治性B細胞前體ALL患者的中位OS。 其常見的不良反應包括發熱，頭痛，發熱性中性粒細胞減少和外周性水腫。但是由於沒有Fc片段，BiTE抗體分子的體內半衰期很短，試劑使用的時候需要額外配備連續輸液裝置。2017年Blinatumomab全球銷售達1.75億美元（2014年300萬美元、2015年0.77億美元、2016年1.15億美元）。

其他在研雙特異性抗體

目前有多個雙特異性抗體正在開展用於治療腫瘤的臨床試驗，其結構中多包含CD3抗原結合位點（用於募集T細胞到腫瘤細胞附近），另一個結合位點包括CD19,CD20,CD33,CD123,HER2,CEA，神經節苷脂GD2，PSMA，gpA33等等。另外，還有一些雙特異性抗體為：HER2 + HER3, IL1α+IL1β,IL13+IL17, IL17A/IL17F和CD30+CD16A。

部分終止臨床的雙特異性抗體：在進入臨床用於治療腫瘤的雙特異性抗體中，共有8個臨床試驗被終止。

5、國內雙特異性抗體研發企業

據不完全統計，國內目前從事雙特異性抗體研發的企業共有19家，其中上市公司3家，分別為珠海麗珠、江蘇恆瑞、浙江海正藥業，非上市公司16家，分別為武漢友芝友（石藥佔股40%）、武漢中美華世通、蘇州康寧傑瑞、蘇州信達、蘇州天演藥業、蘇州博生吉（安科生物佔股20%）、上海君實生物、上海復宏漢霖（復星醫藥子公司）、上海岸邁生物、上海健能隆（合肥億帆子公司）、上海宜明昂科、北京康眾生物、北京天廣實、深圳本康生物、中山康方生物、杭州特瑞思。

武漢友芝友：友芝友是一家專門從事生物醫藥自主創新研發的高科技企業。從團隊上講，友芝友是一個由院士領銜，製藥巨頭研發高管參與的國際化背景團隊。CDE的數據顯示，友芝友自主開發的「注射用重組抗HER2和CD3人源化雙特異性抗體」(M802)和「注射用重組抗EpCAM和CD3人鼠嵌合雙特異性抗體」（M701），分別於2017年9月29日和2018年3月6日獲得臨床批件。

武漢中美華世通：中美華世通成立於2009年，由「國家千人計劃」專家張發明博士回國創立。其子公司杭州翰思生物致力於腫瘤免疫領域生物大分子的研發及產業化，自主研發的PD-1目前已在進入國內二期臨床。臨床前品種圍繞PD-1布局多個雙特異性抗體，包括PD-1/CD47,PD-1/IL-10,PD-1/VEGF,CD47/VEGF等等，其中PD-1/CD47（HX009）目前已完成中試，正在猴子體內進行長毒試驗，預計明年中獲得臨床批件。

蘇州康寧傑瑞：CRIB（Charge Repulsion Improved Bispecific）是康寧傑瑞自主研發的雙特異性抗體平臺，基於完整的抗體框架結構，通過有針對性的調整不同Fc鏈之間的電荷網絡分布，大大增加異二聚體形成的機率的同時，阻礙同二聚體的形成，從而達到構建雙特異性抗體分子的目的。目前康寧傑瑞的研發的「注射用重組人源化抗HER2雙特異性抗體」已於2018年4月10號獲得臨床批件，另外還有多個雙特異抗體處於臨床前研究。

蘇州信達生物：信達生物製藥致力於做國內最好、國際一流的高端生物製藥公司。在雙特異性抗體領域，信達生物與岸邁生物、禮來達成合作協議，獲得岸邁生物的FIT-Ig平臺技術的全球權益，開發包括IBI302在內的雙靶點單克隆抗體注射液。IBI302可用於治療多種眼底黃斑疾病和實體瘤，通過同時阻斷疾病發生和發展過程中的兩個靶點，達到標本兼治的效果，顯著優於現有治療水平。

蘇州天演藥業：天演藥業成立於2012年，致力於開發新一代治療性和診斷用抗體技術的生物製藥公司。公司的藥物篩選平臺「動態高精度抗體技術」突破了生物抗體藥物研發麵臨的兩大瓶頸：如何擴展治療性抗體的靶向空間和如何提高抗體藥物開發的成藥性。目前，天演藥業已經建立了高質量的、多樣性達千億的可開發性抗體庫，能精準地設計、構建及篩選治療性抗體，並能生成針對不同靶點的單特異性與雙特異性抗體，包括傳統上難以生成抗體的複雜靶點的但特異性及雙特異型抗體產品線。

蘇州博生吉：博生吉醫藥以腫瘤細胞免疫治療技術與產品為主要發展目標、以臨床技術服務為主要業務的高科技企業。博生吉以細胞療法為主，但在雙特異性抗體方面也嶄露頭角，公司研發的針對多發性骨髓瘤的CD3/CD138 BiTE在細胞水平上展現了骨髓瘤細胞的殺傷作用。

上海君實生物：君實生物是一家以開發治療性抗體為主的研髮型高科技公司，專注於創新單克隆抗體藥物和其他治療性蛋白藥物的研發與產業化，已搭建國內一流創新人源化抗體藥物產品研究開發技術平臺。該平臺涵蓋分子抗體藥物篩選、高產穩定CHO細胞株的構建及治療性抗體分析檢測在內的多個核心技術。公司旗下目前在研的雙特異型抗體候選藥物主要有兩款：創新性人源化JS005雙特異抗體注射液、創新型人源化JS003雙特異抗體注射劑。

上海復宏漢霖：復宏漢霖由復星醫藥與美國科學家團隊於2009年12月合資組建，公司主要致力於應用前沿技術進行單克隆抗體生物類似藥、生物改良藥以及創新單抗的研發及產業化。目前，復宏漢霖有14個單抗藥物處於在研階段，其中雙特異性抗體藥物兩個（HLX31、HLX32）。

上海岸邁生物：岸邁生物成立於2016年，主要關注腫瘤領域的雙特異性抗體研發。岸邁生物的核心技術是雙特異性抗體研發平臺FIT-lg，FIT-Ig是一項新型的構建雙特異性抗體的技術平臺，保留了單克隆抗體的主要基本結構元素及生物學特性，同時可以結合及抑制兩種不同的致病因子(靶源)，並且該項技術已經通過了對產品的可藥性和產業化規模生產的驗證。目前公司正全力將現有產品向臨床推進，預計第一個產品將於2018年進入臨床試驗階段。

上海健能隆：健能隆醫藥建立了免疫抗體技術平臺ITabTM（Immunotherapy Antibodies），啟動了一系列雙特異性抗體藥物的開發，用於多種實體瘤和血液腫瘤的免疫治療。利用該技術憑條設計合成的雙特異性抗體分子具有獨特的結構特徵，可在真核細胞中表達，易於大規模生產。

上海宜明昂科：宜明昂科生物醫藥技術（上海）有限公司創立於2015年6月， 致力於腫瘤的免疫治療產品的開發研究，在研產品包括針對免疫調節靶點的單克隆抗體、經過武裝的靶點特異性NK細胞以及雙特性性抗體。公司針對CD47靶點的單抗已於2018年9月1日獲得NMPA臨床試驗研究受理。

北京康眾生物：康眾生物的腫瘤T細胞生物治療技術平臺，基於其獨創的羊駝納米抗體快速分離技術，用於重點研發納米抗體雙特異性抗體（nanoBiTE）。BiTE(Bispecific T-cell engager)技術是採用DNA重組技術將識別T細胞的CD3抗體與其它抗體的重鏈和輕鏈可變區通過連接肽連接形成單一的雙特異性抗體，這種抗體能夠介導T細胞和靶細胞之間形成溶細胞行免疫連接，有效殺傷腫瘤細胞。

北京天廣實：是一家處於臨床階段的生物製藥公司，具備國內領先的單抗藥物研發和產業化技術能力並形成了完善的技術體系。根據CDE的數據顯示，公司的「注射用重組人源化雙功能單克隆抗體MBS301（HER2-D2/D4）」已於2018年8月27日獲得臨床批件。

深圳本康生物：成立於2015年，主要從事生物製藥和細胞治療創新工具和技術解決方案的開發。公司技術團隊中不乏出自安進、拜耳這些巨頭公司的研發人才，依託公司在蛋白質工程領域多年的研究經驗，公司儲備了大量有望改造和提升細胞治療技術的工具，涵蓋雙特異性抗體藥物開發、細胞培養方案及基於磁珠的細胞分離技術以及細胞檢測等諸多方面。目前一共有5個雙特異性抗體藥物，其中有三個正在展開臨床試驗，除了一項是在美國申報以外，其他兩項試驗尚未公布申報地點。

中山康方生物：AK-104是中山康方生物醫藥開發的一種雙特異性抗體，同時靶向於CTLA-4和PD-1。CTLA-4和PD-1是在腫瘤浸潤淋巴T細胞上共表達的免疫檢查點蛋白，康方研發的AK104能同時阻斷這兩個通路。AK-104目前已在澳大利亞啟動了臨床一期試驗，用於治療晚期實體瘤。中山康方生物醫藥已於2017年11月向CFDA藥品審評中心遞交了該藥的新藥臨床試驗(IND)申請。

杭州特瑞思：特瑞思是由國家「千人計劃」專家吳幼玲博士領導的海外歸國精英聯合浙江民營企業家創立的，是一家集研發、中試放大和商業化生產、銷售為一體的創新生物製藥企業。公司擁有豐富的產品管線，其中2個雙特異性抗體處於臨床前研究，分別是TRS008（治療非小細胞肺癌、尿路上皮癌）、TRS009（治療肺癌、黑色素瘤、膀胱癌，消化道腫瘤）。TRS008是特瑞思於2018年4月與上海岸邁生物合作引進的品種，浙江特瑞思該藥的中國市場開發權益,岸邁生物將保留該項目除中國以外的全球商業權益。

6、結語

雙特異性抗體是抗體藥物領域最新的一個概念，被視為治療腫瘤的第二代抗體療法。國內雖然有多家企業布局雙特抗體領域，但多處於臨床前研發狀態，進入臨床階段僅有武漢友芝友、蘇州康寧傑瑞、北京天廣實等幾家企業。作為一種前瞻技術，其在產業化面臨諸多挑戰，如解決錯配和純化，改善下遊工藝不穩定，保證雙抗的穩定性和平衡兩個抗體的表達量等。隨著技術的進步，相信未來可以利用更多更好的策略來優化各種雙特異性抗體，使其具有更強大的療效和更低的副作用，為腫瘤患者帶去福音。

7、參考文獻

曾靜，雙特異性抗體在腫瘤免疫治療中的研究進展

袁慶雲，雙特異性抗體藥物在抗腫瘤治療中的應用

閆莉萍，雙特異性抗體藥物非臨床研究的考慮要點

郭婷婷，雙特異性抗體藥物的研究進展

吳丹青，雙特異性抗體技術及其臨床應用進展

黎曉維，雙特異性抗體的結構設計及其裝配工藝研究進展

房世娣，雙特異性抗體的結構及應用研究進展

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