2019年9月30日訊/
生物谷BIOON/---基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜誌列為2013年年度十大科技進展之一,受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短回文重複序列的簡稱,Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在
細菌體內發現的,是
細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。
圖片來自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。
2018年11月26日,中國科學家賀建奎聲稱世界上首批經過基因編輯的嬰兒---一對雙胞胎女性嬰兒---在11月出生。他利用一種強大的基因編輯工具CRISPR-Cas9對這對雙胞胎的一個基因進行修改,使得她們出生後就能夠天然地抵抗HIV感染。這也是世界首例免疫愛滋病基因編輯嬰兒。這條消息瞬間在國內外網站上迅速發酵,引發千層浪。有部分科學家支持賀建奎的研究,但是更多的是質疑,甚至是譴責。
即將過去的9月份,有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發現呢?小編梳理了一下這個月生物谷報導的CRISPR/Cas研究方面的新聞,供大家閱讀。
1.Science:全文解讀!開發出CRISPR LiveFISH技術,成功對活細胞中的DNA和RNA進行實時成像基因組編輯可以誘導包括易位在內的染色體重排。儘管測序方法已用於鑑定和描述與遺傳疾病和基因編輯有關的染色體異常,但是染色體重排的時間動態變化鮮為人知。
之前的研究依賴於使用基因組整合的LacO/TetO陣列,這既枯燥又有挑戰性。與螢光蛋白融合在一起的沒有核酸酶活性的dCas9,或者招募單向導RNA(sgRNA)的與螢光蛋白融合在一起的RNA結合蛋白能夠對基因組位點進行CRISPR介導的實時成像。但是,對編碼CRISPR組件的DNA的需要限制了它的使用。傳統的螢光原位雜交(FISH)需要DNA變性,同時在體外與sgRNA組裝在一起的螢光標記dCas9(CASFISH)僅檢測固定樣本中的基因組位點,這就限制了實時追蹤。
在一項新的研究中,來自美國史丹福大學、卡斯迪加學校和中國浙江大學的研究人員報導了一種稱為CRISPR活細胞螢光原位雜交(CRISPR live-cell fluorescent in situ hybridization, CRISPR LiveFISH)的實時成像方法,從而允許研究活細胞中的各種染色體功能。相關研究結果發表在2019年9月20日的Science期刊上,論文標題為「CRISPR-mediated live imaging of genome editing and transcription」。
圖片來自Science, 2019, doi:10.1126/science.aax7852。
這些研究人員報導了用於活細胞DNA和RNA成像的CRISPR LiveFISH技術。化學合成的螢光gRNA與dCas蛋白形成的複合物能夠促進快速穩健地、可擴展地對細胞(包括原代細胞)中的基因組DNA進行追蹤和對細胞中的RNA進行成像。在富含核糖核酸酶的環境中,對Cas9:gRNA:DNA三元複合物中gRNA的靶DNA依賴性保護會富集靶信號,同時讓背景噪音最小化。CRISPR LiveFISH也允許對活細胞中內源性基因組位點上發生的CRISPR誘導的基因編輯和易位事件進行動態追蹤。使用dCas9和dCas13系統的雙DNA/RNA CRISPR LiveFISH能夠對相同細胞中的基因組DNA和RNA轉錄本進行實時成像。人們有可能將CRISPR LiveFISH與其他的基因操縱技術(比如,CRISPRi/a、表觀遺傳修飾和CRISPR-GO)結合使用來加深對基因組組裝和細胞核事件的時空動態變化的理解。
2.Science子刊:利用CRISPR/HDR技術進行工程化改造有望賦予雜交瘤抗體多樣化的功能!如今,生物工程師和生命科學家能夠結合雜交瘤技術來製造大量相同的抗體,同時還能開發出新型的抗體療法和診斷技術,近年來該技術的臨床前和臨床研究都突出了抗體型別對於治療效果的重要性。
單克隆抗體(mAb)的應用徹底改變了醫學領域,其能用來治療曾經科學家認為無法治癒的多種疾病。從1975年開始,雜交瘤技術被廣泛應用於單克隆抗體的發現、篩選和生產,在過去10年裡,科學家們為臨床研究製造了大量雜交瘤,並對其進行了驗證和發展,其中mAb的形式和型別對於理解其在臨床前模型中的表現非常重要。基因工程所產生的mAbs通常採用重組技術進行生產,其中的可變結構域能進行測序、並且克隆到質粒中,在瞬態系統中進行表達;但這些過程比較耗時、具有挑戰性且成本高昂,會嚴重阻礙臨床前的研究進程。
在一項最新研究中,來自荷蘭的研究人員開發出了一種多用途的CRISPR和同源定向修復(HDR)平臺,其能夠快速設計免疫球蛋白結構域並形成重組雜交瘤,其能夠分泌設計抗體的首選格式、物種或亞型。研究人員認為,這種通用型的平臺或將能夠促進大規模抗體工程研究,助力科學家們進行臨床前的抗體研究工作。
3.Nat Commun:新研究發現細菌中的CRISPR-Cas9防禦系統藉助高度先進的顯微鏡和同步加速器,哥本哈根大學的研究人員對細菌抵禦其他細菌和病毒的分子機制提出了開創性的見解。相關結果發表在最近一期的《Nature Communications》雜誌上。這一發現可能會成為將來與疾病作鬥爭的重要基石。
研究人員展示了被病毒攻擊的細胞如何激活稱為COA(環狀寡聚腺苷酸)的分子,而COA則激活一種稱為CSX1的蛋白複合物,以清除發起攻擊的病毒。
「以通俗的說法,CSX1能夠弱化入侵者的侵染力。一旦COA被激活,我們就能看到CSX1如何被激活,進行旋轉並開始保護細胞免受感染。」諾和諾德基金會蛋白質研究中心的Guillermo Montoya教授解釋說。
哥本哈根大學的研究人員還成功地激活了這一過程。他們給這種蛋白複合物提供COA分子,從而啟動了防禦機制。「簡而言之,我們發現了一個開關,可以在我們需要的時候開啟細胞的防禦系統,這樣我們就可以消除潛在的攻擊,」Montoya教授說道道。
4. Nat Biotechnol:新型納米膠囊高效輸送Cas9核糖核酸蛋白複合物用於體內基因組編輯編輯遺傳密碼的新工具為遺傳性疾病、某些癌症甚至頑固病毒感染的新療法帶來了希望。但是,將基因療法傳遞到身體特定組織的典型方法可能是複雜的,並可能導致令人不安的副作用。威斯康辛大學麥迪遜分校的研究人員通過將基因編輯有效載荷裝入可定製的微型合成納米膠囊中解決了其中的許多問題。近日他們在《Nature Nanotechnology》雜誌上描述了這種新型的遞送系統。
威斯康辛大學麥迪遜分校生物醫學工程教授、全美基因組編輯協會指導委員會聯席主席Krishanu Saha表示:"在注射基因療法後,編輯體內錯誤的組織是一個嚴重的問題。"該協會得到了美國國立衛生研究院(National Institutes of Health) 1.9億美元的資助。"如果生殖器官被無意中編輯了,那麼病人就會把編輯的基因遺傳給他們的孩子和後代。"
Gong的實驗室將基因治療的有效載荷--也就是基因編輯工具CRISPR-Cas9的一個版本,用Saha實驗室設計的導向RNA--包裹在一個薄的聚合物外殼上,形成一個直徑約25納米的膠囊。納米膠囊的表面可以裝飾有多肽等官能團,使納米顆粒能夠靶向某些細胞類型。
納米膠囊在細胞外保持完整--例如,在血液中--只有在目標細胞內被一種叫做穀胱甘肽的分子觸發時才會分裂。然後,釋放的有效載荷移動到細胞核,編輯細胞的DNA。由於納米膠囊在細胞細胞質內的壽命較短,因此有望減少意外的基因編輯。
5.Nat Biotechnol:構建出具有自我編輯活性的DNA鹼基編輯器在一項新的研究中,Julian Grünewald等人描述了對SECURE-BE3變體進行結構引導的改造,其中SECURE-BE3變體具有下降的脫靶RNA編輯活性和可比較的在靶DNA編輯活性,也是迄今為止描述的最小釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9鹼基編輯器之一。相關研究結果發表在2019年9月的Nature Biotechnology期刊上,論文標題為「CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities」。
圖片來自Nature Biotechnology, 2019, doi:10.1038/s41587-019-0236-6。
他們還測試了基於除APOBEC1以外的胞苷脫氨基酶的CBE,結果發現基於人APOBEC3A的CBE誘導大量的RNA鹼基編輯,然而基於APOBEC3A的增強型CBE6、基於人激活誘導的胞嘧啶脫氨酶(activation-induced cytidine deaminase)的CBE7和基於七鰓鰻(Petromyzon marinus)胞苷脫氨酶的CBE Target-AID4誘導較少的RNA編輯。
最後,他們發現表現出RNA脫靶編輯活性的CBE和ABE也能夠對它們自身的轉錄本進行自我編輯,從而導致鹼基編輯器編碼序列出現異質性。
6.Mol Ther:CARSPR-cas9技術能夠治療杜氏肌營養不良杜氏肌營養不良症(DMD)是一種罕見但十分嚴重的遺傳性疾病,可導致肌肉的流失與機體的損傷。DMD患者存在的基因突變會導致一種名為dystrophin的蛋白質的產生受阻。沒有dystrophin的存在,肌肉細胞會變弱,直至最終死亡。許多孩子因此失去了行走能力,最終維持呼吸和心臟功能所必需的肌肉也會停止工作。最近,由密蘇裡大學醫學院的研究人員作出的一項研究表明:基因編輯技術CRISPR可以為糾正導致該疾病發生的基因突變提供終生性的手段。
「基於動物模型的研究表明,CRISPR可用於糾正導致肌肉細胞異常死亡的基因突變,」該文章的資深作者Dongsheng Duan博士說到:「然而,由於這些基因編輯的肌肉細胞會隨著時間的推移而逐漸老去。因此,如果我們可以糾正肌肉乾細胞中的相關突變,那麼再生的肌肉細胞將不再攜帶該突變。」
首先,研究人員通過AAV9向正常小鼠肌肉注入基因編輯載體。「我們將AAV9處理的肌肉移植到免疫缺陷的小鼠體內。移植的成年肌肉細胞會率先死亡,然後幹細胞中再生新生的肌肉細胞。如果幹細胞能夠被成功編輯,那麼再生的肌肉細胞也應攜帶編輯的基因。」
研究人員的推理是正確的,因為他們在再生肌肉中發現了大量的,已經經過編輯細胞。並且這些細胞能夠正常產生dystrophin蛋白。
7.Nat Commun:新型CRISPR方法鑑定出弓形蟲在宿主體內存活的關鍵基因在一項新的研究中,通過使用一種基於CRISPR的基因篩選方法,來自英國弗朗西斯-克裡克研究所的研究人員鑑定出弓形蟲在小鼠體內存活的關鍵基因。相關研究結果近期發表在Nature Communications期刊上,論文標題為「A CRISPR platform for targeted in vivo screens identifies Toxoplasma gondii virulence factors in mice」。
這項研究提供了一種靈活的新方法,可用於擴大CRISPR篩選的使用範圍。這種方法還允許在小鼠體內同時測試弓形蟲的數百個基因,從而極大地減少了所使用的研究動物的數量。
論文共同第一作者、弗朗西斯-克裡克研究所博士後研究員Joanna Young說,「通過選擇一部分基因進行靶向,我們不會在弓形蟲能夠繁殖之前冒著壓倒宿主的風險。我們用弓形蟲突變體庫感染小鼠,我們預測它們會與宿主發生相互作用。這揭示了新的毒力因子,並證實了之前的研究中已知的那些毒力因子。」
8.Nat Chem Biol:利用CRISPR/Cas9鑑定出調節抗體-藥物偶聯物毒性作用的基因化學療法起作用的基本前提是殺死所有快速生長的細胞,以消滅腫瘤細胞。這種策略雖然通常是有效的,卻會造成相當多的脫靶傷亡,比如,它會殺死產生毛髮的細胞和位於胃部內壁的細胞。科學家們試圖通過製造類似飛彈的藥物來解決這個問題,這些藥物特異性地攻擊癌細胞而不會傷害健康細胞。美國史丹福大學醫學院遺傳學研究生Kimberly Tsui表示,這些類似飛彈的藥物稱為抗體-藥物偶聯物(antibody-drug conjugates, ADC),已開展了數十年的研究,但是僅在近年來,它們才進入臨床試驗。
如今,在一項新的研究中,Tsui、史丹福大學醫學院遺傳學助理教授Michael Bassik博士和一組研究人員正在利用基因編輯技術來更好地了解ADC如何對癌細胞給予致命打擊。相關研究結果近期發表在Nature Chemical Biology期刊上,論文標題為「CRISPR-Cas9 screens identify regulators of antibody–drug conjugate toxicity」。Tsui是論文第一作者。這項研究是與史丹福大學ChEM-H主任Carolyn Bertozzi博士合作完成的。
圖片來自CC0 Public Domain。
Bassik和Tsui使用基因編輯技術CRISPR/Cas9來確定哪些基因可以幫助ADC進入癌細胞。
Tsui說,「通過我們的CRISPR篩查系統,我們可以一次關閉一個基因,從而找出哪些基因對ADC的毒性作用很重要。」通過使用這種方法,他們試圖了解哪些基因有助於加強ADC的毒性作用,或者抑制ADC的毒性作用。
9.Genome Research:基因治療可以減少肥胖,逆轉小鼠的2型糖尿病全球近5億人受到肥胖的影響,其中很多是兒童。與肥胖相關的疾病,包括心臟病、中風、2型糖尿病和癌症,是可預防死亡的主要原因。肥胖是由遺傳因素和環境因素共同造成的,影響了有效的抗肥胖藥物的開發,這些藥物存在嚴重的脫靶效應。在近日發表在《Genome Research》雜誌上的一項研究中,研究人員開發了一種基因療法,可以專門降低肥胖小鼠的脂肪組織,逆轉與肥胖相關的代謝疾病。
為了克服目前抗肥胖藥物的副作用,研究人員Jee Young Chung和同事開發了一種針對脂肪酸代謝基因Fabp4的特殊基因沉默療法。研究人員使用了CRISPR幹擾系統,其中催化死亡的Cas9蛋白和單導RNA與組織特異性融合肽靶向白色脂肪細胞。複合物內化後對細胞毒性小,內化後,分子複合物降低Fabp4的表達,減少脂肪細胞內脂質儲存。為了證明這種傳遞方法在細胞中表現良好,Chung和他的同事在肥胖小鼠身上測試了他們的治療方法。給老鼠餵食高脂肪食物會導致肥胖和胰島素抵抗。Fabp4的抑制作用使患者的體重減輕了20%,並在僅僅6周的治療後改善了胰島素抵抗和炎症。研究人員同時還觀察到其他的全身改善,包括減少脂肪脂肪沉積在肝臟和減少循環甘油三酯。
10.PNAS:科學家用CRISPR成功治療三陰性乳腺癌!波士頓兒童醫院(Boston Children's Hospital)的研究人員稱,一種腫瘤靶向CRISPR基因編輯系統可以有效且安全地阻止三陰性乳腺癌的生長,該系統被封裝在納米凝膠中,並注射到體內。他們在人類腫瘤細胞和小鼠身上進行的原理驗證研究,提出了一種潛在的基因治療三陰性乳腺癌的方法。在所有乳腺癌中,三陰性乳腺癌的死亡率最高。美國國家科學院院刊(PNAS)近日在網上報導了這項新的專利保護策略。
這項由波士頓兒童血管生物學項目的Peng Guo博士和Marsha Moses博士領導的新研究首次成功地使用了靶向CRISPR基因編輯技術來阻止TNBC腫瘤在體內的生長(通過注射到活的荷瘤小鼠體內)。這種新系統無毒,可以利用抗體選擇性地識別癌細胞,同時不損傷正常組織。實驗表明,CRISPR系統能夠鎖定乳腺腫瘤,並敲除一種著名的促進乳腺癌的基因--脂質運載蛋白2,對腫瘤組織的編輯效率達到81%。該方法使小鼠模型的腫瘤生長速度降低了77%,對正常組織沒有毒性。(生物谷 Bioon.com)