基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜誌列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短回文重複序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。
接下來，小編列舉最近一段時間CRISPR基因編輯系統取得的重大進展，詳情如下所示。
在一項新的研究中，來自美國加州理工學院的研究人員開發出一種新的方法來讀取細胞的歷史和「譜系圖」。 這種被稱作光學原位讀取人工突變存儲（Memory by Engineered Mutagenesis with Optical In situ Readout, MEMOIR）的方法能夠記錄動物細胞的生命歷史---它們與其他細胞之間的關係，溝通模式和影響它們的重大事件。相關研究結果於2016年11月21日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「Synthetic recording and in situ readout of lineage information in single cells」。
兩種新的強大工具有助實現這個目標。在一種被稱作基因組編輯的工具中，在DNA切割系統CRISPR的幫助下，一種發育中的有機體的遺傳密碼能夠在任何指定的靶位點上發生改變。寫在一個細胞基因組中的任何改變可傳遞給它的後代。在動物發育早些時候發生的改變將出現在它的很多細胞中，然而較為近期的改變將出現在更少的細胞中。通過分析發生的DNA編輯模式，研究人員能夠鑑定出這些細胞的共同祖先和計算出它們的親緣關係如何，比如，他們能夠確定哪些細胞是兄弟姐妹。類似的方法已被用於多種科學領域，包括中世紀史。
另一種工具，被稱作順序單分子螢光原位雜交（sequential single molecule Fluorescence In Situ Hybridization, seqFISH），是由Cai開發的，用於了解哪些基因在單個細胞中是有活性的。在最近的一篇發表在Neuron期刊上的論文中，Cai團隊展示了這種技術如何能夠被用來確定200多種基因在單個細胞中的表達水平。這種方法也讓研究人員在細胞的體內起源位置處分析它的基因活性。之前的技術需要這些細胞與它們的自然環境相分離。
在這項新的研究中，研究人員將這兩種工具結合在一起：seqFISH方法被用來追蹤通過CRISPR基因編輯引入到基因組中的變化。
這個系統不僅能夠被用來了解細胞譜系信息，而且也能夠被用來了解這些細胞過去發生的事件---它們何時接收來自彼此的信息或者它們何時從一種細胞類型變成另一種細胞類型。比如，當腫瘤產生時，一些細胞可能接受來自其他細胞的不同分子信號，從而引發截然不同的命運。一種細胞可能變成轉移性的和能夠遷移，而另一種細胞保持靜止不動。追蹤過去的信號如何影響當前的細胞命運的能力可能為腫瘤的時空發育提供一種新的視角。
2. ACS Nano：繼全球首次人體臨床實驗後，川大華西CRISPR研究再獲新進展
doi:10.1021/acsnano.6b04261
近日，來自四川大學華西生物治療國家重點實驗室的魏於全院士課題組首次採用人工病毒進行CRISPR-Cas9基因編輯系統輸送，成功在小鼠腫瘤模型中完成了靶基因編輯，達到了較好的腫瘤治療效果，相關成果發表在《美國化學學會·納米》雜誌上。
。雖然目前為止已經有不少研究用CRISPR進行腫瘤基因編輯，但是這些研究存在著不少問題，使用的方法臨床轉化也相當困難。目前研究採用的體內給藥CRISPR-Cas9質粒DNA的手段主要有三種，一種是水流動力學注射，即將約為小鼠體重10%的DNA質粒注射液通過尾靜脈在3-8秒內注射到小鼠體內（腦補一下打點滴時的情形），這會造成血壓瞬間升高，可能造成器官損傷，在人體內幾乎無法實現；另一種方式則是採用腺病毒載體進行CRISPR質粒DNA的輸送，但是腺病毒具有免疫原性，有引發免疫反應的風險，最重要的是由於CRISPR質粒DNA太大，腺病毒負載能力實在太低，因此效率不高，心有餘而力不足；第三種則是局部注射質粒，其缺點不言而喻，對於人體深部疾病似乎鞭長莫及啊。
基於此，魏於全院士課題組合成了一種新型的人工病毒載體用於CRISPR-Cas9質粒DNA的輸送，他們合成了靶向乳腺癌中的MTH1基因（一個可以促使基因組穩定、阻止細胞死亡的基因，乳腺癌病人腫瘤組織高表達）的CRISPR-Cas9質粒DNA（Cas9-hMTH1）在小鼠體內進行了實驗驗證。由於質粒DNA帶負電，他們選擇了帶正電的氟原子修飾的聚乙烯亞胺（PF33）與質粒DNA混合，通過正負電荷相互作用形成人工病毒（PF33/ Cas9-hMTH1，實際上就是一種納米顆粒），同時為了增強人工病毒的輸送柯剩遣捎靡恢侄喙δ芨叻腫GD-R8-PEG-HA對人工病毒進行修飾得到了靶向MTH1的多功能核殼結構CRISPR-Cas9輸送人工病毒（RRPHC/Cas9-hMTH1），這種高分子可以使人工病毒更穩定，同時避免被免疫系統清除，RGD和HA可以同時靶向結合腫瘤部位高表達的整合素ανβ3和CD44受體，從而提高人工病毒在腫瘤部位的富集。同時，腫瘤部位高表達的透明酸質（HA）酶可以降解HA，促進Cas9-hMTH1在腫瘤中的釋放，從而增強療效。
體外細胞轉染實驗表明該人工病毒的轉染效率明顯高於商用轉染試劑SuperFect、Lipofectamine 2000及Lipofectamine 3000，表明該載體可以更有效攜帶Cas9-hMTH1進入細胞，同時雙重靶向策略可以使該人工病毒更特異性結合併進入乳腺癌細胞完成基因敲除。功能性實驗表明該人工病毒可以成功敲除MTH1，導致癌細胞凋亡，顯著抑制乳腺癌細胞增殖。通過小鼠尾靜脈注射人工病毒（僅含5 微克 Cas9-hMTH1，而文獻報導水動力學注射需要100 微克左右）後，可發現小鼠腫瘤組織有較多的人工病毒富集，免疫組化分析也顯示腫瘤部位MTH1蛋白表達量顯著降低，同時小鼠腫瘤生長及轉移也得到了明顯的抑制。最後他們對人工病毒的安全性進行了評價，血細胞計數發現注射人工病毒對血細胞數量無明顯影響，基因測序顯示正常組織中的突變率均低於0.4%，且都不是插入或者缺失突變，僅為單鹼基替換突變。
雖然他們認為該人工病毒具有較好的安全性，可以用於腫瘤特定基因的敲除進行腫瘤治療，但是筆者認為0.4%的突變率是不是還是有點高呢，有沒有辦法再優化一下繼續降低脫靶率呢？據報導，他們下一步的研究計劃是使用這種人工病毒輸送其他CRISPR-Cas9質粒DNA及功能化的DNA結合蛋白用於拓展該人工病毒的應用範圍。
3.利用CRISPR研究基因組「暗物質」
超過98%的人類基因組由非編碼基因組成。這些非編碼基因被稱為基因組的「暗物質」，它們能調控編碼基因的表達，從而影響人類健康和疾病進程。自從人類基因組序列被公開發表以來，科學家們努力解析基因中的功能元件，包括非編碼調節區——參與轉錄調節的順式調節區和非編碼RNA（ncRNA）。轉錄因子在整個基因組中可能有數百至數千個結合位點，因此研究起來非常複雜。目前常用的兩種研究轉錄因子調控基因表達位點的方法是：1，耗時且複雜的增強子研究；2，在非天然狀態中克隆增強子或啟動子序列，開展並行研究。最近Sanjana等人和Fulco等人的研究都指出，可以利用CRISPR技術在天然狀態裡研究非編碼調控元件的功能。
大規模的生化試驗使人們發現了由潛在的、被數百種蛋白靶向結合的調節序列。值得一提的是，識別脫氧核糖核酸酶I超敏感位點（deoxyribonuclease I hypersensitive site， DHS）和大規模染色質免疫沉澱測序（chromatin immunoprecipitationsequencing， ChIP seq）方法的提出，讓科學家們能夠全面地解析蛋白與染色質結合的情況。然而，把這些分子和功能調控聯繫起來非常困難。
由於使用不同的CRISPR載體可以無偏向性地敲除蛋白編碼基因，因此CRISPR篩選是研究非編碼基因功能的有力工具。與人類細胞中NGG（前間區序列鄰近基序）序列上遊的基因序列同源的單引導RNA（single guide RNA， sgRNA）可以引導CRISPR系統到達特定基因組位點，從而特異性地引起突變。首個CRISPR「敲除」篩選研究在基因組規模上誘導了全基因敲除，並克服了RNA幹擾篩選中的諸多限制，例如脫靶效應和敲除不完全（圖：CRISPR-Cas9篩選方法）。
Sanjana等人使用CRISPR工具來研究黑色素瘤細胞中調控vemurafenib（B-Raf蛋白V600E突變中，600位點的纈氨酸被穀氨酸所替代，而Vemurafenib抑制攜帶了V600E突變的B-Raf蛋白中的絲氨酸 蘇氨酸蛋白激酶結構域）抗性的序列。研究人員使用CRISPR工具靶向主要的抗性調節區域——NF1（neurofibromatosis type 1，神經纖維瘤病1型基因）、NF2（neurofibromatosis type 2，神經纖維瘤病2型基因）和CUL3（cullin 3，泛素連接酶3）。該方法中，嚮導RNA和反式激活crRNA（trans-activating crRNA）融合，引導來源於釀膿鏈球菌的Cas9（spCas9）在目標位點處誘導DNA雙鏈斷裂，從而產生突變。結果顯示，靶向CUL3的sgRNA在轉錄起始點最為富集。sgRNA富集的區域，CUL3被敲除，這表明，CUL3似乎與染色體相互作用、組蛋白翻譯後修飾，以及轉錄因子結合位點阻斷的調控區域相關。
Fulco等人利用CRISPR幹擾系統，即利用失活的Cas9和KRAB蛋白融合，沉默靶向序列的表達。這種方法雖然實現了靶向性的基因沉默，但並未引起基因突變。研究者們設計的靶向序列圍繞在MYC和GATA1基因附近（這兩個基因能調控K562紅白血病細胞的增殖）。他們首先使用病毒感染細胞，將CRISPRi系統載帶進入細胞，然後使用多西環素誘導dCas9靶向目標序列。他們發現，sgRNA富集點恰好和包含多個轉錄因子結合位點的DHS重合。更有趣的是，dCas9靶向GATA1或組蛋白脫乙醯酶6（HDAC6）增強子時，都會減少HDAC6表達。這表明，對於共同的增強子（GATA1和HDAC6存在共同的增強子），基因之間存在競爭關係。鑑定出來的MYC增強子的位置與轉錄起始位點、CCCTC-結合因子（CTCF，介導染色質相互作用）結合位點都是吻合的。這可能是MYC調控細胞增殖的機制。
4.基因編輯器CRISPR讓突變小鼠觸手可得
如今，絕大多數小鼠培育者都知道CRISPR。長久以來，JAX和其他培育新的小鼠品系的實驗室依賴於一個辛苦費力的多步驟過程，其中涉及利用基因工程技術改變小鼠的胚胎幹細胞，將其注射進胚胎，並且培育若干代小鼠。即便是JAX最好的團隊，也需要用2年時間才能成功改造一隻小鼠。CRISPR利用一種可在受精卵上開展針對性基因手術的分子複合物替代了所有這一切。它能在6個月內產生一種被改造的小鼠。
Jaenisch首次證明了CRISPR在產生基因敲除小鼠方面的威力。在研究人員首次證實CRISPR在哺乳動物細胞中奏效的5個月後，Jaenisch和同事於2013年5月在《細胞》雜誌上發表了一篇論文。他們報告稱，該技術成功斷開了一組小鼠胚胎幹細胞中的5個基因，而這在以前是不可能的。更重要的是，他們證實可完全繞過胚胎幹細胞，並且同時敲除單細胞小鼠受精卵中的兩個基因。研究人員不再需要改造胚胎幹細胞並不辭辛苦地培育若干代小鼠，以產生卵子或精子細胞中攜帶基因突變的小鼠。同時，研究人員若想培育擁有兩個突變的小鼠，也不再需要將單突變體雜交並經歷一個類似的耗時且煩瑣的流程，以獲得擁有被改變生殖細胞系的小鼠後代。
自此以後，已有500餘篇論文詳細描述了CRISPR如何敲除以及敲入小鼠基因。「它產生的影響是巨大的。」在1974年培育出首個轉基因小鼠的Jaenisch表示。加拿大多倫多大學生物化學家Tak Mak則認為，此項技術真正改變了獲得這些被改造動物的時間和效率。據Mak估測，和利用胚胎幹細胞相比，利用CRISPR改造小鼠的花費要便宜30%左右，從而使他的平均成本大大降低。
CRISPR的影響不能僅通過節省成本來衡量。此項技術的便利和速度使得在匆忙之中改造小鼠成為可能，從而解決了來自多倫多病童醫院的C. C. Hui最近面臨的特定問題：在基因敲除過程中，缺失基因未產生任何可觀察到的效應。Hui意識到，被敲除的基因同另一個可能對其作出補償的基因存在關聯。他向在多倫多表型基因組學中心監管小鼠培育的Lauryl Nutter求援。Nutter利用CRISPR使來自初始基因敲除過程的受精卵中的幹擾基因發生突變。「我們獲得了受精卵，將CRISPR-Cas9注射進去。8周後，Hui便獲得了雙突變體。」Nutter介紹說，「如果利用胚胎幹細胞，可能需要好幾年才能完成。」
5.Nature：中國首次利用CRISPRCas9編輯過的細胞開展人體臨床試驗
doi:10.1038/nature.2016.20988
來自中國成都市四川大學華西醫院的一個研究人員團隊首次將利用CRISPRCas9進行過基因編輯的細胞注射到一名病人體內。《自然》期刊報導這一注射過程是在2016年10月28日發生的，而且迄今為止，這名病人表現得 「還不錯」。
經過基因修飾的細胞之前已被注射到人體內，但是是利用不同的技術實現的。CRISPR-Cas9被認為是一種更加高效的方法。在這項新的努力中，該團隊從血液樣品中分離出免疫細胞，然後利用CRISPR-Cas9尋找它們中的PD-1蛋白，並且讓該蛋白不能發揮功能，而之前的研究已證實這會延緩免疫細胞作出的免疫反應。人們的看法是讓這種蛋白失去功能將允許免疫系統更強地抵抗腫瘤生長。這些利用CRISPR-Cas9進行過基因編輯的細胞被放置在一個容器中，在那裡，它們在體外培養後能夠發生增殖---它們隨後經收集後被注射到一名肺癌病人體內，其中這名病人已不能夠對任何其他的療法作出反應。
這種CRISPR-Cas9技術涉及利用一種結合特定DNA序列的嚮導RNA和一種能夠在事先選擇的位點上切割DNA鏈的Cas9酶，從而允許移除DNA鏈，或者加入新的DNA片段。
這項研究是由四川大學華西醫院腫瘤學家盧鈾教授領導的。它涉及一名已接受注射的病人和9名其他的志願者。
盧鈾團隊披露出，這名病人已被安排第二次接受利用CRISPRCas9進行過基因編輯的免疫細胞注射，但是未給出具體的時間。這名病人和這項臨床試驗的9名其他的志願者將被密切監控6個月的時間來確定這些接受過基因編輯的細胞是否會導致任何不良影響---直到那時盧鈾團隊才會著重關注這些細胞是否確實在延緩或逆轉癌症生長中發生影響。
6.Nature：重磅！首次利用CRISPR-Cas9對非分裂細胞進行基因編輯
doi:10.1038/nature20565
在一項新的研究中，來自美國沙克研究所的研究人員發現基因編輯的聖杯---首次能夠在基因組的靶位點上將DNA插入到非分裂細胞（non-dividing cell）中，其中非分裂細胞佔成年器官和組織中的大多數。他們證實這種技術能夠部分恢復失明的嚙齒類動物的視覺反應。它將為基礎研究和多種治療視網膜疾病、心臟疾病和神經疾病等疾病的方法打開新的途徑。相關研究結果於2016年11月16日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration」。
在此之前，修飾DNA的技術---如CRISPR-Cas9系統---已最為有效地利用分裂細胞（dividing cell）的正常複製機制在這些細胞（如在皮膚或腸道中的那些細胞）當中在發揮作用。沙克研究所開發的這種新技術在將新的DNA整合到體外培養的分裂細胞中的效率比其他方法高10倍，使得它成為一種大有希望的用於研究和藥物開發的工具。但是，更為重要的是，這種新技術首次代表著科學家們成功地將一種新的基因插入到不再發生分裂的成體細胞（如在眼睛、大腦、胰腺或心臟中的那些細胞）中準確的DNA位點上，從而為在這些細胞中進行治療應用提供新的可能。
為了做到這一點，研究人員瞄準一種被稱作非同源末端連接（non-homologous end-joining, NHEJ）的DNA修復細胞通路，其中NHEJ通過將發生常規斷裂的DNA鏈末端重新連接在一起對斷裂的DNA進行修復。他們將這個過程與現存的基因編輯技術組合使用，從而成功地將新的DNA插入到非分裂細胞中的精確位點上。
7.Nature子刊：北大魏文勝、哈佛劉小樂課題組完成首次CRISPR lncRNA基因高通量功能篩選
doi:10.1038/nbt.3715
CRISPRCas系統是近年來興起的一種高效的基因編輯技術，具有廣泛的應用範圍，其中就包括功能基因篩選。人們可以建立一個單鏈嚮導RNA（sgRNA）的庫，用其中的sgRNA去靶向作用於多種基因的編碼區域，然後再以所研究功能相關的目標表型對結果進行評估，從而找到與該功能相關的基因。
這一策略利用了細胞中傾向於產生差錯DNA修復途徑——非同源性末端接合（NHEJ），通過CRISPRCas系統在目標基因片段中製造DNA雙鏈斷裂，是細胞採用NHEJ進行修復，最終在原斷裂位點留下插入/缺失突變。對於編碼蛋白的基因，少數鹼基對的加入或去除便可能帶來移碼突變、錯義突變等嚴重影響蛋白正常功能的因素，最終反映在表型上。
然而，對於轉錄非編碼RNA的基因來說，上述策略則難以用於功能篩選，因為僅有插入/缺失突變很可能並不能顯著影響轉錄產物的表型。為此，人們需要製造影響更大的突變，比如基因中大片段的缺失，以造成可觀察到的表型改變，而這樣的突變可以通過配對嚮導RNA（pgRNA）來實現。CRISPRCas系統在兩種分別靶向目標基因不同位點的gRNA的指導下，在同一基因中造成兩處DNA雙鏈斷裂。在細胞對DNA進行修復的過程中，上述兩個斷裂點之間的基因片段可能會被「遺漏」，最終不會出現在修復完畢的基因中。
最近，北京大學魏文勝教授和哈佛大學劉小樂教授的聯合團隊基於上述策略，以慢病毒為載體構建出pgRNA庫，在全基因組範圍內對人源肝癌細胞系Huh7.5OC中的近700個癌症或其他疾病相關長鏈非編碼RNA（lncRNA）的基因進行了功能篩選。這一成果發表於近期的Nature子刊《Nature Biotechnology》上。
研究者以細胞增殖為表型，採用MAGeC