2020年9月30日訊/
生物谷BIOON/---基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜誌列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短回文重複序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在
細菌體內發現的，是
細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。
圖片來自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。
2018年11月26日，中國科學家賀建奎聲稱世界上首批經過基因編輯的嬰兒---一對雙胞胎女性嬰兒---在11月出生。他利用一種強大的基因編輯工具CRISPR-Cas9對這對雙胞胎的一個基因進行修改，使得她們出生後就能夠天然地抵抗HIV感染。這也是世界首例免疫愛滋病基因編輯嬰兒。這條消息瞬間在國內外網站上迅速發酵，引發千層浪。有部分科學家支持賀建奎的研究，但是更多的是質疑，甚至是譴責。
即將過去的8至9月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發現呢？小編梳理了一下這兩個月生物谷報導的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閱讀。
1.Nat Commun：利用AIOD-CRISPR超靈敏地可視化檢測新冠病毒在一項新的研究中，在康乃狄克大學健康中心生物醫學工程系副教授Changchun Liu博士的領導下，研究人員開發出的這種稱為「All-In-One-Dual CRISPR-Cas12a（AIOD-CRISPR）」的方法簡單地、快速地、超靈敏地可視化檢測SARS-CoV-2，可在家庭或小診所使用。相關研究結果於2020年9月18日發表在Nature Communications期刊上，論文標題為「Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay」。
AIOD-CRISPR測試方法的設計與工作原理，圖片來自Nature Communications, 2020, doi:10.1038/s41467-020-18575-6。
在這項新的研究中，Liu和他的研究團隊使用28個臨床COVID-19拭子樣本的RNA提取物評估了他們的AIOD-CRISPR方法，其中包括8個COVID-19陽性樣本。為了確保檢測的可靠性，每個樣本都在兩個獨立的實驗中測試了兩次。所有8個COVID-19陽性樣本均在40分鐘內確診為陽性，而且是通過目視檢測予以確認的。這些結果也與美國疾控中心（CDC）批准的RT-PCR方法的結果一致。
這些研究人員還使用低成本的暖手寶作為孵育器來檢測患者樣本，以消除對電孵育器的需求。AIOD-CRISPR試管被直接放置在一個氣動的暖手寶上，在LED燈下用肉眼就可以看到檢測結果。
2.Mol Cell：新研究揭示DNA損傷後的組蛋白降解促進DNA修復DNA損傷可能發生在基因組的任何地方，但大多數DNA被包裹在核小體上，這就使得修復複合體無法進入。如今，在一項新的研究中，來自瑞士弗雷德裡希米歇爾生物醫學研究所和巴塞爾大學等研究機構的研究人員發現DNA會誘導組蛋白耗竭，這增加了DNA纖維的可訪問性和靈活性，並提高了同源重組修復過程中的同源搜索速度。相關研究結果於2020年9月23日在線發表在Molecular Cell期刊上，論文標題為「DNA Damage-Induced Nucleosome Depletion Enhances Homology Search Independently of Local Break Movement」。論文通訊作者為Susan M.Gasser博士。
在這項新的研究中，Cheblal及其同事們強調，組蛋白降解和隨後的染色質解壓縮（chromatin decompaction）確實會提高DNA修復效率和動力學。Cheblal總結了這項研究的主要發現：「我們發現，DNA雙鏈斷裂可以通過組蛋白的受控降解引發異位的染色質解壓縮[指的是在遠處未受損的位點，而非局部]，這對基於同源重組的DNA修復至關重要。我們還發現，局部斷裂動態對DNA修復不那麼重要，可以通過增加異位染色質移動來加以彌補，而異位染色質移動與染色質解壓縮相關。此外，我們排除了之前的一個假設：染色體從核外周脫離是DNA損傷反應的一部分。」
當被問及這項研究的更廣泛影響時，Cheblal說，「我們的研究將對CRISPR介導的基因療法至關重要，目前這種療法的效率太低，無法用於臨床。我們的研究結果表明將這項技術與經過適當上調的因子結合起來誘導組蛋白降解，可能會提高CRISPR-Cas9的編輯效率。」
通過同源重組修復DNA是CRISPR-Cas9靶向基因組編輯的基本原理。CRISPR-Cas9編輯技術主要作為研究工具，但也用於基因治療。初步研究表明，在哺乳動物細胞中，隨著組蛋白的耗竭，CRISPR-Cas9的編輯效率可以提高。
3.Nature子刊：經改進靶向毒性RNA的CRISPR-Cas9有望治療強直性肌營養不良I型CRISPR-Cas9是一種越來越多地用於校正導致各種疾病的基因（DNA）缺陷的技術。幾年前，美國加州大學聖地牙哥醫學院的研究人員改變了這種技術的作用方向：用一種他們稱之為RNA靶向Cas9（RNA-targeting Cas9, RCas9）的方法來修飾RNA。
在一項新的研究中，這些研究人員證實一劑RCas9基因療法可降解有毒的RNA，並且幾乎完全逆轉強直性肌營養不良小鼠模型的症狀。相關研究結果於2020年9月14日在線發表在Nature Biomedical Engineering期刊上，論文標題為「The sustained expression of Cas9 targeting toxic RNAs reverses disease phenotypes in mouse models of myotonic dystrophy type 1」。
圖片來自Nature Biomedical Engineering, 2020, doi:10.1038/s41551-020-00607-7。
這些研究人員將RCas9包裝在一種非感染性病毒中，這種病毒載體將這種RNA切割酶遞送到細胞內。他們給這些小鼠注射了單劑RCas9基因療法或模擬治療（mock treatment，指的是未包裝RCas9的病毒載體）。RCas9將異常的重複性RNA減少了50%以上，根據組織的不同而有所變化，而且治療後的強直性肌營養不良小鼠變得與健康小鼠基本沒有區別。
4.NEJM：COVID-19快速檢測有望提升準確度自從COVID-19大流行開始以來，麻省理工學院以及哈佛大學的研究人員，以及致力於開發基於CRISPR的COVID-19診斷程序，該程序可以在30分鐘到一個小時內產生結果，其準確性與現在使用的標準PCR診斷程序相似。
該名為STOPCovid的新測試仍處於研究階段，但原則上可以廉價地製造，人們可以每天進行自我檢測。在《New England Journal of Medicine》雜誌上發表的一項研究中，研究人員表明，在一組患者樣本中，他們的檢測發現了93％的陽性病例。
具體而言，研究人員通過添加吸引RNA的磁珠來濃縮患者樣品中的病毒遺傳物質，從而無需使用費時且昂貴的純化試劑盒。由於需求量大。此濃縮步驟提高了測試的靈敏度，直到接近PCR的靈敏度。
5.Nat Biotechnol：科學家有望利用酶類測試來改善CRISPR基因編輯工具的精準性和有效性！近日，一項刊登在國際雜誌Nature Biotechnology上的研究報告中，來自德克薩斯大學等機構的科學家們通過研究開發了一種新工具能幫助科學家們為特定的工作選擇最佳的可用基因編輯選項，從而就使得CRISPR技術更加安全、便宜和高效。近年來，CRISPR基因編輯技術在改善人類健康、農業研究等方便表現出了巨大的潛力，但其所面臨的挑戰在於基因編輯的微妙性質，即不允許出錯，為了實現基因編輯，科學家們會使用來自名為CRISPR的自然系統中幾十種不同的酶類，隨後他們會鎖定出問題的DNA序列，緊接著利用酶類作為剪刀來剪斷錯誤序列，使得遺傳物質被添加、移除或改變，但這些剪刀或許並不完美，其準確性和有效性會因CRISPR酶和項目而異，而且新的工具會引導新的用戶，因此研究者可以為其高風險的基因編輯選擇最好的CRISPR酶類。
研究者Steve Jones博士表示，我們設計了一種新方法，其能幫助檢測這些不同的CRISPR酶的特異性，其能以一種前所未有的方式來對抗任何引起DNA序列的改變；當CRISPR酶靶向作用了錯誤的DNA片段後問題就會出現，每一種CRISPR酶在編輯不同的序列上都會存在一定的優缺點，因此研究人員就開始著手開發一種工具來幫助科學家們比較不同的酶類並尋找你一種能發揮用途的最佳酶類。
6.Nat Cell Biol：利用CRISPR對免疫反應進行編輯，使得基因療法更有效基因治療一般依靠腺相關病毒（AAV）等病毒將基因遞送到細胞中。在基於CRISPR的基因療法中，分子剪刀可以移除有缺陷的基因，並添加一個缺失的序列或暫時改變它的表達，但人體對AAV的免疫反應會阻礙整個努力。
圖片來自Nature Cell Biology, 2020, doi:10.1038/s41556-020-0563-3。
為了克服這一障礙，來自美國匹茲堡大學醫學院的研究人員在一項新的研究中構建出一種以不同方式使用CRISPR的系統。他們的系統短暫地抑制了與AAV抗體產生有關的基因，這樣這種病毒就可以不受阻礙地遞送它攜帶的基因貨物。相關研究結果近期發表在Nature Cell Biology期刊上，論文標題為「Synthetic immunomodulation with a CRISPR super-repressor in vivo」。
7.Sci Adv：新型基因療法有望治療遺傳性失明患者色素性視網膜炎是一種最常見的先天性失明症，近日，一項刊登在國際雜誌Science Advances上的研究報告中，來自德國慕尼黑大學等機構的科學家們通過對色素性視網膜炎小鼠模型進行研究發現，靶向激活具有相似功能的基因或能彌補主要的缺陷。
研究者Becirovic表示，目前有兩種策略用於基因療法的開發，在基因補充的背景下，研究者會試圖利用完整的基因版本來替代缺陷的基因，然而這種策略僅適用於相對較少的基因；而第二種策略的目標就是糾正誘發疾病的突變，但這通常需要針對每個單獨的突變量身定做，為了克服這些困難，研究人員通過研究開發出了一種新型策略；人類基因組中的許多基因都屬於某些家族，其家族成員在不同類型的細胞中發揮著相類似的功能，或者在特定細胞類型分化的過程中的不同階段會被激活，研究人員的想法就是通過特異性地激活具有相似功能但在視網膜細胞中並不表達的基因來彌補突變基因缺失的功能，為了做到這一點，研究人員將名為Cas9-VPR的系統運輸到了受影響的視網膜細胞中開始進行研究。
Cas9-VPR系統是CRISPR/Cas9技術的衍生技術，與經典的CRISPR/Cas9技術相似的是，Cas9-VPR能利用相同的靶向原則來引導激活的蛋白質進入感興趣的特定基因位點發揮作用；隨後研究者利用色素性視網膜炎小鼠模型來檢測這種技術，這些小鼠模型缺乏在正常情況下能在視網膜視杆細胞中進行表達的光敏視紫紅蛋白，在一種無害病毒的幫助下，研究人員將Cas9-VPR系統成功導入到了視杆細胞中，當將Cas9-VPR系統引入到小鼠的視杆細胞後，研究人員就能夠開啟與視紫紅質基因密切相關的基因的表達，視紫質基因在負責顏色和白天視覺的視錐細胞中通常情況下處於激活狀態；以這種方式，研究人員就能彌補視杆細胞中視紫紅質功能的缺失，從而就能降低視網膜退行性病變的速度，並能改善視網膜的功能，從而還不對患者機體產生明顯的副作用。
8.PLoS Pathog：我國科學家開發出一種快速、準確、低成本的COVID-19測試方法在一項新的研究中，來自中國廣東省醫學科學院、雲南農業大學、中國醫學科學院、北京協和醫學院、復旦大學附屬華山醫院和徐州醫科大學附屬醫院等研究機構的研究人員報導一種新型低成本的COVID-19測試方法可在不需要複雜設備的情況下快速提供準確的測試結果。相關研究結果於2020年8月27日發表在PLoS Pathogens期刊上，論文標題為「Development and evaluation of a rapid CRISPR-based diagnostic for COVID-19」。
在這項新的研究中，這些研究人員利用近年來廣泛用於基因編輯的CRISPR技術，開發了一種替代性的COVID-19測試方法。這種被命名為CRISPR-COVID的測試方法能夠高通量檢測SARS-CoV-2--導致COVID-19的新型冠狀病毒。CRISPR-COVID可在短短40分鐘內提供與mNGS相當的靈敏度和特異性。當大規模生產時，CRISPR-COVID測試的材料成本可低於70美分，這表明CRISPR-COVID不僅在技術上，而且在財務上也是一個有競爭力的替代方案。
9.Science子刊：重大進展！移植經過CRISPR基因編輯的人棕色脂肪樣細胞有望治療肥胖和糖尿病肥胖是導致2型糖尿病和相關慢性疾病的主要原因，今年它在全球引起的死亡人數加起來將超過新型冠狀病毒SARS-CoV-2。在一項新的研究中，來自美國哈佛醫學院、中國醫藥大學、丹麥哥本哈根大學、新加坡國立大學、巴西聖保羅大學、韓國基礎科學研究院和浦項科技大學等研究機構的研究人員針對這種危險的疾病，提出了一種新型細胞療法的概念驗證方法。相關研究結果發表在2020年8月26日的Science Translational Medicine期刊上，論文標題為「CRISPR-engineered human brown-like adipocytes prevent diet-induced obesity and ameliorate metabolic syndrome in mice」。
移植到小鼠體內後的各種脂肪組織的顯微圖。頂部的圖片是各種脂肪組織的一般形態，底部的圖片是用對hUCP1染色的組織切片（紅色），這是棕色脂肪細胞所特有的。這些圖片顯示，雖然HUMBLE細胞在形態上與白色脂肪細胞相似，但是它們表達棕色脂肪特有的hUCP1蛋白。圖片來自Science Translational Medicine, 2020, doi:10.1126/scitranslmed.aaz8664。
論文通訊作者、哈佛醫學院喬斯林糖尿病中心的Yu-Hua Tseng博士表示，這種潛在的肥胖療法是移植人棕色脂肪樣細胞（human brown-like fat cell, HUMBLE細胞），即人類白色脂肪細胞經過基因改造後變得類似於產生熱量的棕色脂肪細胞。
10.Mol Cell：中科院高彩霞課題組開發出具有高特異性和高精度的胞嘧啶鹼基編輯器在一項新的研究中，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞（Gao Caixia）教授課題組基於截短的人APOBEC3胞嘧啶脫氨酶（A3Bctd）構建出兩種新的CBE，並開發出一種高通量檢測方法，用於評估植物CBE中不依賴於單向導RNA（sgRNA）的脫氨變化。相關研究結果於2020年7月27日在線發表在Molecular Cell期刊上，論文標題為「Rationally Designed APOBEC3B Cytosine Base Editors with Improved Specificity」。
他們首先開發了一種快速、高通量且廉價的方法---nSaCas9介導的正交R環測定法---來評估植物中的CBE。在這種測定法中，正交CRISPR系統nSaCas9被用於在植物細胞中產生單鏈DNA（ssDNA）區域，作為不依賴於sgRNA的脫氨變化的靶標。為了評估nSaCas9介導的正交R環測定，他們將它與全基因組測序（WGS）測定進行了比較。
一致性的結果表明，nSaCas9介導的正交R-loop測定法為評估CBE的不依賴於sgRNA的脫靶活性提供了一種合理、快速和高通量的方法。
他們隨後通過合理設計構建出16個A3Bctd脫氨酶變體，並評估了它們的在靶效率（on-target efficiency）和不依賴於sgRNA的脫靶活性。他們利用nSaCas9介導的正交R環測定法對這些A3Bctd-BE3變體進行了測試，並選擇了7個與高效的在靶編輯活性和下降的脫靶活性相關的突變。之後，他們將這些突變進行組合，產生了9個新的具有雙胺基酸或三胺基酸替換的A3Bctd-BE3變體。通過這種方式，他們得到了兩個新的CBE變體：A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3，這兩個變體表現出高效的在靶活性和明顯下降的不依賴於sgRNA的脫靶活性。
11.Mol Cell：從結構上揭示出最大最複雜的CRISPR-Cas系統的作用機制在一項新的研究中，來自丹麥哥本哈根大學、中國山東大學和華中農業大學的研究人員利用先進的低溫電鏡（CryoEM）技術成功地可視化觀察最大最複雜的CRISPR-Cas系統的三維結構。他們認為這種系統可能在生物醫學和生物技術方面有潛在的應用。相關研究結果於2020年7月29日在線發表在Molecular Cell期刊上，論文標題為「Structures of the Cmr-β Complex Reveal the Regulation of the Immunity Mechanism of Type III-B CRISPR-Cas」。
論文共同通訊作者、哥本哈根大學諾和諾德基金會蛋白研究中心的Guillermo Montoya教授說道，「我們解析出迄今為止所看到的最大、最複雜的CRISPR-Cas複合物的三維結構。我們如今了解了這種系統是如何在分子水平上發揮作用的。」這些研究人員研究了一種稱為Cmr-β的複合物，它屬於所謂的III-B型CRISPR-Cas複合物的一個亞組。
12.Science論文深度解讀！基因編輯大牛揭示鹼基編輯器的作用機制在短短八年內，CRISPR-Cas9已經成為基礎研究和基因治療的首選基因組編輯器。但CRISPR-Cas9也催生了其他潛在的強大DNA操縱工具，從而可能幫助修復導致遺傳性疾病的基因突變。在一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校的研究人員如今獲得了這些最有前途的工具之一---鹼基編輯器---的首個詳細的三維結構，這為調整鹼基編輯器使之在患者中的使用更加靈活和可控提供了一個路線圖。相關研究結果發表在2020年7月31日的Science期刊上，論文標題為「DNA capture by a CRISPR-Cas9–guided adenine base editor」。
圖片來自Molecular Cell, 2020, doi:10.1016/j.molcel.2020.07.008。
論文共同第一作者、加州大學伯克利分校博士後研究員Gavin Knott說，「我們第一次能夠觀察到鹼基編輯器在發揮作用。如今，我們不僅可以了解它什麼時候起作用，什麼時候不起作用，而且還可以設計下一代鹼基編輯器，使之變得更好、更適合於臨床使用。」
論文共同第一作者、前加州大學伯克利分校博士後研究員Audrone Lapinaite（如今為亞利桑那州立大學助理教授）說，「我們實際上第一次觀察到鹼基編輯器作為兩個獨立的模塊運行：一個是dCas9模塊，它提供特異性；另一個是催化模塊，它提供編輯活性。我們獲得的這個鹼基編輯器與它的靶標結合在一起時的結構真地給了我們一種思考Cas9融合蛋白的方法，總體而言，這給我們提供了dCas9的哪個區域更有利於與其他蛋白融合在一起的想法。」（生物谷 Bioon.com）