2020年基因編輯技術最新研究進展

導讀 基因編輯（gene editing）是一種能比較精確地對生物體基因組特定目標基因進行修飾的一種新興基因工程技術。在20世紀80年代始，基因編輯技術開始不斷發展。而在CRISPR基因編輯技術橫空出世之後，基因編輯技術有了突飛猛進的發展。

基因編輯已經開始應用於基礎理論研究和生產應用中，這些研究和應用，有助於推進生命科學許多領域的發展，從研究植物和動物的基因功能到人類的基因治療。

本文中，小編整理了2020年科學家們在基因編輯研究領域的重要研究進展，分享給大家！

【1】CRISPR兩大「宗師」合作，揭示單鹼基編輯器3D結構，解析脫靶機制

基因編輯領域兩位「宗師」David Liu及Jennifer A. Doudna合作，首次揭開了一種「最有前途」的鹼基編輯器的3D結構，為調整鹼基編輯器，使之在應用過程中更加靈活和可控提供了一個參考。早期的腺嘌呤鹼基編輯器（ABE）效率都很低。然而，最新的ABE8e卻快到令人驚訝，對DNA的脫氨基速率比ABE7.10和miniABEmax分別高出590倍和1170倍。然而，這也意味著，ABE8e可能更容易造成脫靶效應。對此，研究人員利用冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）成像技術，解析了ABE8e結合DNA時的3D結構。活性檢測表明， ABE8e之所以容易產生更多的脫靶編輯，是因為與Cas9融合的脫氨酶蛋白始終處於活躍狀態。由於這項研究首次報告了這種融合蛋白的結構，它可能有助於指導無數其他基於Cas9的基因編輯工具的設計。該研究於7月31日發表在《科學》雜誌上。

ABE8e捕獲DNA時的Cryo-EM結構

【2】David Liu再獲新突破：無需實驗，就能知道基因編輯結果

David R. Liu團隊在哺乳動物細胞中38,538個基因組整合靶標上表徵了11個胞嘧啶和腺嘌呤鹼基編輯器（CBE和ABE）的序列-活性關係，並使用所得結果訓練了BE-Hive機器學習模型，可準確預測鹼基編輯基因型結果（R ≈0.9）和效率（R≈0.7）。研究人員以≥90％的準確度糾正了3388個與疾病相關的單核苷酸變異（SNV），其中包括675個等位基因，其「旁觀者」核苷酸被BE-Hive正確預測，因此無法編輯。該研究發現了先前無法預測的C-to-G或C-to-A編輯的決定因素，並利用這些發現以≥90％的準確性糾正了174個病原性SNV編碼序列。利用BE-Hive設計新的CBE變體，以調節編輯結果。這些發現啟發了鹼基編輯，實現了以前難以處理的目標的編輯，並為新的基礎編輯器提供了改進的編輯功能。該研究於7月23日發表在《Cell》雜誌。

【3】迄今最小基因編輯工具，體積僅為CRISPR-Cas9的一半！

加州大學伯克利分校創新基因組學研究所的研究人員發現了一種新型基因編輯工具——CasΦ，一種最小的CRISPR-Cas系統，由1〜70 KD的CasΦ蛋白和一個CRISPR陣列組成，且僅在巨大噬菌體的基因組中編碼，其體積是CRISPR-Cas 9的一半。研究人員發現CasΦ在其天然環境中是一種功能性噬菌體蛋白和真正的CRISPR-Cas效應子，能夠裂解crRNA互補的DNA。此外，這種單RNA系統比其他活性CRISPR-Cas系統緊湊得多。其中，具有單個指導RNA的CasΦ-2能夠編輯多達33％的細胞，這與先前報導的CRISPR-Cas9，CRISPR-Cas12a和CRISPR-CasX的水平相當。這項研究於7月17日發表在《科學》雜誌上。

巨噬細胞編碼的CasΦ在其宿主的超感染情況下的功能示意圖

【4】葉海峰團隊開發出遠紅光激活的基因編輯系統

華東師大葉海峰團隊開發出了遠紅光（730 nm）激活的Split-Cas9（FAST）系統，該系統可無創地誘導動物組織內部深處的細胞中的基因編輯活性。FAST系統依賴於兩個具有高親和力結合域的分裂Cas9融合蛋白：Cas9的一半是組成性表達的，而另一半由該研究團隊先前建立的細菌光敏色素BphS光學控制系統的FRL誘導控制。最初，研究人員在人類胚胎腎（HEK）-293細胞中放置了FAST系統組件，並使用基於發光二極體（LED）的遠紅光（FRL）照射來證明靶向基因組編輯的成功激活。之後，在不同的人類細胞系中實現了FRL誘導編輯後，研究人員通過植入物實驗，證實FAST能夠在位於動物皮下組織的細胞中強有力地激活基因編輯。然後，他們在轉基因tdTOMATO報告小鼠系的實驗中，建立了FRL誘導的小鼠體細胞（肝細胞）的快速介導編輯，以及在異種移植瘤小鼠中對癌細胞進行細胞周期失活基因編輯的研究，以此證明了FAST能夠對抗疾病。這項研究於7月17日發表在《科學進展》雜誌上。

FAST系統的設計

【5】劉如謙團隊再作創舉！首次開發線粒體基因編輯工具！

繼「單鹼基編輯法」和「先導編輯」這兩大基因編輯技術突破後，全球基因編輯領域的頂尖學者，麻省理工學院和哈佛大學布羅德研究所的化學生物學家劉如謙（David R. Liu）團隊發現，一種細菌毒素，DddA，可以將胞嘧啶（C）轉化為尿嘧啶（U）。DddA可直接作用於雙鏈DNA，無需依靠Cas9酶來進行破壞。該研究使用首個不依賴CRISPER鹼基編輯器——DdCBE，實現了對線粒體基因組的精準編輯，這是前所未有的研究和治療線粒體遺傳病的工具。除了試圖創建人類線粒體疾病的細胞和小鼠模型外，研究人員還將尋找其他可以修飾雙鏈DNA的細菌脫氨酶。他們還希望提高編輯效率並減少脫靶編輯，以便最終可以在人類中測試mtDNA基礎編輯。該研究於7月8日發表在《自然》雜誌。

【6】CRISPR編輯iPSC新進展：首次報告協同基因編輯效應

日本京都大學iPS細胞研究所的科學家最新研究表明（Nature Communications，2020），DNA DSB修復與細胞周期之間有協同作用，有利於ssOND介導的單核苷酸基因編輯。在iPS細胞中建立了基於GFP到BFP轉化的螢光DNA修複測定方法，可視化定量單等位基因和雙等位基因靶向過程中DNA修復結果的頻率。研究發現，通過特定培養條件和小分子調節DNA修復和細胞周期，可協同增強同源性定向修復（HDR）的頻率。但是，高頻HDR編輯主要導致雙等位基因報告基因系統中純合突變體的產生，為了在這些條件下生產雜合突變體，這個團隊採用了使用混合ssODN修復模板的策略，來保護具有沉默突變的一個等位基因。在內源性常染色體位點應用此協同基因編輯策略，與基線HDR水平相比，精確編輯生成的雜合和純合突變提高了幾倍。該研究於6月8日發表於《自然通訊》雜誌。

【7】李大力團隊開發新型雙鹼基基因編輯器

儘管鹼基編輯器是用於精確基因組編輯的有用工具，但是當前的鹼基編輯器只能轉換腺嘌呤或胞嘧啶。華東師範大學李大力團隊通過將兩個脫氨基酶與一個Cas9切口酶融合來開發腺嘌呤和胞嘧啶雙鹼基編輯器（A＆C-BEmax），以在同一目標位點實現C-to-T和A-to-G轉換。與單鹼基編輯器相比，A＆C-BEmax對腺嘌呤的活性略有降低，而對胞嘧啶的活性較高，RNA脫靶活性大大降低。這項研究成果於6月1日發表在《自然生物技術》雜誌。

【8】擺脫PAM限制，基因編輯工具再升級

哈佛醫學院和麻省總醫院的Benjamin P. Kleinstiver實驗室再度對SpCas9蛋白進行了強勢升級，改造後的SpCas9突變體SpRY幾乎完全擺脫了PAM困擾，其識別的PAM序列涵蓋NRN和NYN（Y為C/T）（NRN > NYN）。SpRY和以此為基礎構建的單鹼基編輯系統在PAM為NRN的位點處展現出強大的編輯能力，而在PAM為NYN的位點處的編輯能力雖然有所降低，但依然可觀。該研究開發的SpCas9突變體SpRY是當前對PAM序列兼容性最高的SpCas9突變體，幾乎完全擺脫了PAM序列的限制，其在基因組範圍內的編輯能力得到了極大的提高，而衍生而來的單鹼基編輯系統讓精準編輯幾乎拓展至全基因組範圍。這項研究成果於3月27日發表在《科學》雜誌上。

針對基因編輯領域的研究不勝枚舉，以上僅羅列了其中的一小部分。在基因編輯技術取得一個又一個突破後，又因其技術上的潛在風險而飽受爭議。未來基因編輯技術又該何去何從？我們能否合理的利用這把「上帝賜予的手術刀」？這是一個值得思考的問題。但在未來，科學家將對基因編輯的機制進行深入的剖析，相信有朝一日，科學家能夠利用基因編輯技術克服疾病，造福人類健康。