精準基因編輯技術的研究進展

自2012年，CRISPR/Cas9基因組編輯系統被首次發現之後，國內外的研究者對於其優化升級和應用一直沒有停息過——為了獲得一種更精準、更便捷和更經濟的基因組編輯工具而不斷探索和實踐。我們都知道，CRISPR/Cas9基因編輯技術的工作原理是Cas9蛋白切割目標基因形成雙鏈缺口，然後進行目的修復，從而達到修改基因片段的目的。但是這種修復帶有不確定性，引入隨機的插入和缺失。而大約2/3的人類遺傳病和許多動植物的重要性狀的差異都是單核苷酸變異（SNP）引起的，因此精準的單鹼基校正技術在這迫切需求下誕生。

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單鹼基編輯器（CBE和ABE）

基於 CRISPR /Cas9 基因編輯系統，2016 年 4月，哈佛大學生物化學家 David Liu 實驗室率先在《自然》雜誌上報告了一種新的基因編輯工具——單鹼基編輯系統[1]。單鹼基編輯系統主要由 sgRNA 和融合蛋白兩部分組成，其中融合蛋白一般由改造的Cas9 蛋白(dCas9或nCas9)、胞嘧啶脫氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子三者構。sgRNA 通過與靶位點互補配對，引導融合蛋白結合到靶位點發揮作用。融合蛋白中的胞嘧啶脫氨酶能夠使非互補鏈中相應的胞嘧啶 C 經脫氨基作用轉變為尿嘧啶 U，而 DNA 複製進一步使得 U 被 T 代替，而互補鏈上原來與 C 的互補鹼基鳥嘌呤 G 將會變成腺嘌呤 A，而尿嘧啶糖基化酶抑制子則能夠抑制 U 的切除，最終實現非互補鏈上的 C替換為 T 和互補鏈上 G 替換為 A 的精確編輯（如圖1）[1, 2]。該系統被稱為胞嘧啶編輯器 (CBE)，實現 C/G 到 T/A 的轉換。

圖1 CRISPR /Cas9 基因編輯系統和單鹼基編輯的工作原理

進一步的研究發現通過定向進化法在大腸埃希菌中獲得一個突變型的腺苷脫氨酶，可將 DNA 中的腺嘌呤轉化為次黃嘌呤 (I)，後者在 DNA 複製過程中可被識別為鳥嘌呤。即可通過類似於 CBE 的機制實現靶序列中 A/T 到 G/C 的轉換，該系統被稱為腺嘌呤編輯器 (ABE)（如圖2）[3]。CBE 和ABE 系統的建立使單鹼基編輯能實現 4 種形式的鹼基轉換，該系統不依賴於 DNA 雙鏈斷裂的產生，既規避了 NHEJ 修復途徑的隨機性，也擺脫了 HR修復途徑效率低的限制。

圖2 兩種單鹼基編輯器

目前，CBE 和 ABE 系統經過不同程度的改造後，已經應用於動植物基因功能研究和育種中。研究也表明，同一編輯系統對不同靶點的編輯效率差異較大。對於生長發育必需基因，徹底敲除往往會造成植株死亡從而無法獲得敲除體，而通過點突變的方式，這可以對基因進行構象的變化但是不會失活，給基因功能研究帶來了更多的選擇。

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雙鹼基編輯系統

CBE和ABE只能分別誘導產生C>T和A>G點突變，有沒有一種方法可以對於同一等位基因同時實現C>T和A>G的高效轉換呢？2019年8月，日本東京大學Nozomu Yachie實驗室首先開發了新的鹼基編輯器——Target-ACE[4]，原理很簡單在nCas9蛋白上同時融合兩種脫氨酶。隨後，2020年1月13日，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞團隊和李家洋團體合作開發了一種內源基因突變鹼基編輯器STEME[5]，將胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A和腺嘌呤脫氨酶ecTadA-ecTadA7.10同時融合在nCas9的N端，主要用於植物基因的定向進化。研究表明，在水稻原生質體中，STEME-1在同一靶點編輯胞嘧啶和腺嘌呤，C > T的誘導效率達61.61%，C>T和A>G同時突變的效率達15.50%。研究組利用STEME-1和STEME-NG對水稻OsACC基因實現了定向進化，獲得了抗除草劑的定向突變植株。

2020年6月1日，李大力和劉明耀課題組在Nature Biotechnology雜誌發表了一種全新的雙鹼基編輯器——A＆C-BEmax[6]，通過密碼子、核定位信號、linker序列以及UGI串聯等多輪優化後，脫靶率顯著降低、編輯窗口大幅拓寬以及編輯效率也得到了增加。該研究表明A＆C-BEmax能高效地破壞胎兒期血紅蛋白基因HBG1/2啟動子區域轉錄抑制因子BCL11A結合位點（-114C>T或-115C>T）並同時創建新的轉錄激活因子GATA1的結合位點（-113A>G），說明了A&C-BEmax雙鹼基編輯系統對於精準治療β-血紅蛋白病具有巨大的潛力。

與單鹼基編輯器相比，雙鹼基編輯系統能實現60個額外的密碼子更改（18個胺基酸的替換），可以高效的同時實現A>G和C>T的精準替換，這無疑是給分子育種和基因治療等研究上帶來了巨大的應用潛能。

圖3 Target-ACE的結構

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先導編輯器（Prime Editor,PE）

無論單鹼基編輯器和雙鹼基編輯系統如何改進，最理想的基因編輯器的應該就是PE系統。PE編輯系統不僅可以引入插入和缺失（indels）而且可以實現所有12種鹼基到鹼基的轉換。PE基因編輯系統最先是David R. Liu實驗室在2019年10月21號在Nature上發表[7]，該系統的工作原理是sgRNA被改造成pegRNA（prime editing guide RNA），pegRNA不僅包含引物結合位點(primer binding site, PBS)區域；還攜帶著逆轉錄的模板序列，可以和逆轉錄酶（RT）相結合，實現將pegRNA的序列帶入到目標基因序列中去。研究證明了該系統在人類細胞中可以引進12個點突變，實現範圍是PAM上遊3bp到下遊29 bp，插入達44 bp，缺失達80 bp。David Liu實驗室目前對於PE系統有3個版本：PE1、PE2 和PE3[7]。三個版本的區別在於，PE2在PE1基礎上對M-MLV逆轉錄酶（D200N + L603W + T330P + T306K + W313F）進行了定向的進化，提高了編輯效率，相比於PE1，PE2的點突變效率和鹼基的增刪效率提高了近2倍。對比於PE1/2，PE3系統則是在pegRNA下遊附近，引入了一條與pegRNA方向相反的sgRNA，可以實現切割非互補鏈的目的，提高編輯效率。在293T細胞中，PE3系統的編輯效率可以達到78%。但是值得注意的是，由於是雙鏈斷裂，引物Indels的風險會隨之增加，因此該系統依然需要改進。

由於PE系統巨大的應用價值，在今年3月開始，國內多個研究團隊相繼將PE系統應用於植物中（截至目前，在植物中已經發表了7篇），其中高彩霞課題組和David Liu實驗室合作將PE系統首次應用於植物中，並對此系統進行了改造升級，研究表明了在水稻中利用PE可以產生各種類型的單鹼基替換，但是編輯效率只有0.2-8.0%，可以插入最多15 nt，缺失最多40 nt[8]。其他文章報導的優化方案對編輯效率的提升十分有限。

PE系統目前已經在動植物中有多篇文章報導，但是其編輯效率普遍很低並且不穩定，難以應用於基因治療和分子育種等方面，還需要進一步的優化升級。

圖4 PE工作原理圖

展 望

短短的8年時間，基因組編輯技術實現了飛速發展，由最先對目標基因的隨機打靶失活到現在可以實現對基因單個鹼基的精準替換，技術上已經實現了許多重大突破。但是編輯效率、脫靶等問題上，依舊有待發展。精準的編輯技術對於動植物基因功能研究、基因治療和分子育種等許多方面都有著重要的應用價值，大力發展該技術是迫切需要的，該項技術也是未來國內外研究的重點和熱點。相比於動物，基因編輯技術在植物中監管可能會放寬，這無疑是給精準基因編輯技術在植物中快速發展提供了機會，正如曹曉風院士所說，「基因編輯育種，就是農業領域的5G技術。」

參考文獻

1. Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR: Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 2016, 533(7603):420-424.

2. Nishida K, Arazoe T, Yachie N, Banno S, Kakimoto M, Tabata M, Mochizuki M, Miyabe A, Araki M, Hara KY: Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science 2016, 353(6305).

3. Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI, Liu DR: Publisher Correction: Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 2018, 559(7714):E8.

4. Sakata RC, Ishiguro S, Mori H, Tanaka M, Seki M, Masuyama N, Nishida K, Nishimasu H, Kondo A, Nureki OJb: A single CRISPR base editor to induce simultaneous C-to-T and A-to-G mutations. 2019:729269.

5. Li C, Zhang R, Meng X, Chen S, Zong Y, Lu C, Qiu J, Chen Y, Li J, Gao CJNB: Targeted, random mutagenesis of plant genes with dual cytosine and adenine base editors. 2020:1-8.

6. Zhang X, Zhu B, Chen L, Xie L, Yu W, Wang Y, Li L, Yin S, Yang L, Hu H et al: Dual base editor catalyzes both cytosine and adenine base conversions in human cells. Nature Biotechnology 2020.

7. Anzalone AV, Randolph PB, Davis JR, Sousa AA, Koblan LW, Levy JM, Chen PJ, Wilson C, Newby GA, Raguram AJN: Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. 2019, 576(7785):149-157.

8. Lin Q, Zong Y, Xue C, Wang S, Jin S, Zhu Z, Wang Y, Anzalone AV, Raguram A, Doman JLJNB: Prime genome editing in rice and wheat. 2020:1-4.

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