革命性基因編輯技術引發投資熱點
報告摘要
人工核酸內切酶介導基因編輯技術優於傳統技術，目前應用最普遍
基因組編輯技術(Genome Editing)，是一種能夠對目的基因組進行定點改造，從而對未知功能基因進行研究和基因治療的技術。傳統的基因組編輯技術有Cre-LoxP、Flp-Frt技術等，優點是重組效率高，缺點是耗時長，需要依賴胚胎幹細胞。人工核酸內切酶介導的基因組編輯技術目前應用最普遍，其優勢是擺脫傳統技術對於胚胎幹細胞的依賴並且使用範圍廣，在臨床應用上有很大的潛力。
人工核酸內切酶介導的基因組編輯三大技術包括：ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas
人工核酸內切酶介導的基因組編輯三大技術包括ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas技術。其中 ZFNs技術整合效率高，可用於治療愛滋病；TALENs技術構建較為簡單，可用於治療白血病；CRISPR系統最大優勢在於能夠同時實現多個基因的編輯，並且靶向效率更高。
基因編輯技術應用相關疾病研究取得重大進展
目前，已經有多種模式生物實現了目的基因組DNA的編輯，基因組編輯技術既為這些模式生物中功能基因的研究做出了貢獻，也為相關疾病的研究打下了基礎。我國科學家丁秋蓉首次證明可以通過體內特異靶向敲除PCSK9基因來防治心血管疾病的新基因治療方案，被
美國心血管學會選為2014年心血管領域十大進展。
未來機遇與挑戰並存，前景看好
基因組編輯技術未來的發展趨勢有：與幹細胞結合構建疾病模型，編輯幹細胞基因製備治療性幹細胞，編輯免疫細胞基因製備治療性免疫細胞，深入解析人類基因組學信息，開發CRISPR基因編輯技術為新的基因治療方案。該技術也面臨障礙，因此尋找高效、特異、安全的體內運輸方式，並且同時全面評估CRISPR系統體內編輯的脫靶率和長期安全性將直接決定該技術平臺是否能真正用於臨床基因治療。
投資策略與建議
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風險提示：研發失敗以及政策變化
精準醫療系列研究之一：二代基因測序：下一個百億美金市場；
精準醫療系列研究之二：基因+大數據的顛覆應用：從癌症基因測序到輔助生殖
注釋
ZFNs(Zinc-finger nucleases, ZFNs)：鋅指核酸酶技術
TALENs(transcription activator-like effector nucleases,)：類轉錄激活因子效應物核酸酶技術
CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR associated proteins)：成簇規律間隔短回文重複序列系統 技術
DSB(double strand break)：雙鏈斷裂結構
NHEJ(non-homologous and joining)：非同源末端連接
HDR(homology-directed repair )：同源重組
RVD(repeatvariant diresidues)：重複可變雙胺基酸殘基序列
PAM：原型間隔序列毗鄰區
正 文
一、人工核酸內切酶介導技術優於傳統技術，目前應用最普遍基因組編輯技術(Genome Editing)，是一種能夠對目的基因組進行定點改造的技術。通過對目的基因組的改造，從而達到對未知功能基因進行研究和基因治療的目的。傳統的基因組編輯技術有Cre-LoxP、Flp-Frt技術等，這類技術的優點是重組效率高，缺點是耗時長，需要依賴胚胎幹細胞。人工核酸內切酶介導的基因組編輯技術目前應用最普遍，其優勢是擺脫傳統技術對於胚胎幹細胞的依賴並且使用範圍廣，因此在臨床應用上有很大的潛力。
利用人工內切核酸酶技術進行基因組編輯有兩個需要注意的關鍵環節：
一是利用構建好的人工內切核酸酶與目的DNA片段相結合併且特異性地切割基因組DNA，形成雙鏈斷裂結構(doublestrand break, DSB)；
二是利用目的細胞內的非同源末端連接(NHEJ)或同源重組(HDR)系統來對形成雙鏈斷裂結構進行修復，從而實現對目的基因組的編輯。
關於通過引入移碼突變敲除基因的效率，NHEJ過程要比HR過程效率高很多。考慮到細胞進行NHEJ和HR修復DNA是兩個相互拮抗的過程，Chen Yu等人通過體外篩選的方法找到一些小分子化合物能調節細胞抑制NHEJ過程增強使用HR過程而實現精確的基因組編輯。
二、人工核酸內切酶介導的基因組編輯三大技術介紹人工核酸內切酶介導的基因組編輯技術包括ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas技術。
1、ZFNs技術：整合效率高，但構建難度大、費用高1985年，Miller等首次在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的轉錄因子(transcription factor IIIA, TFIIIA)中發現了具有鋅指結構的蛋白(Zinc-finger protein, ZFP)。鋅指結構是由多個Cys和His殘基通過Zn2+螯合而成的蛋白質結構，包括鋅指DNA結合域和相應限制性內切酶（如FokI，屬於IIS型限制性內切酶）的DNA切割域，能夠識別特定的DNA結合位點並對靶DNA進行切割。通常，一個ZFNs能夠識別9-18 bp長度的鹼基，識別特異性不強，當2個ZFNs分子同時與DNA結合時，其能在2個結合位點的間隔區發生切割作用，從而形成DNA雙鏈斷裂區，啟動NHEJ或HR修復機制。
ZFNs技術是最早發現的人工內切核酸酶介導的基因組編輯技術。與傳統方法相比，ZFNs技術的優點是定點整合效率高，缺點是構建難度大、費用高，這在一定程度上限制了該技術的應用。
在臨床測試中已經取得一定成功的例子是利用鋅指酶技術敲除愛滋患者血液T細胞或者CD4造血幹細胞中的愛滋病毒受體CCR5，從而治療愛滋病。
2、TALENs技術：構建較為簡單，但費用依然偏高TALENs技術是近年發展起來一種對基因組進行定點編輯的新技術，由於其編輯效率十分高效的特點，2012年Science選為年度十大科學突破。
TALENs核酸酶由兩個部分組成：TALE蛋白和核酸內切酶FokI。TALE蛋白家族是一類來源於植物病原菌黃單胞桿菌(Xanthomonas)的分泌蛋白，1989年，Bonas等第一次發現了該蛋白家族的成員AvrBs3。TALE蛋白中的重複可變雙胺基酸殘基(repeat variant diresidues, RVD)序列決定了TALE蛋白的識別特異性，不同的RVD能夠分別對應識別A、T、G、C鹼基中的一種或多種。在應用過程中最常見的4種RVD分別為HD(His-Asp)、NG(Asn-Gly)、NI(Asn-Ile)、NN(Asn-Asn)，其中HD識別C，NG識別T，NI識別A，NN識別G或A。與ZFNs技術相似，核酸內切酶FokI只有形成二聚體時才具有酶切活性，當FokI二聚體對DNA雙鏈進行切割時，會引發NHEJ或HR修復機制，利用該機制可以達到基因組編輯的效果。
TALENs技術與ZFNs技術相比，其優勢在於TALE蛋白的RVD跟靶序列能夠一一對應, RVD與鹼基的結合力不受相鄰RVD的影響，並且比ZFNs更加容易篩選。
TALENs技術與ZFNs技術相比其優點在於構建更為簡單，細胞毒性較低，但構建成本仍然偏高，在應用上也有一定的局限性。
據報導，
英國倫敦大奧蒙德街兒童醫院免疫學家Waseem Qasim 利用TALENs技術對從健康捐獻者血液中分離的T淋巴細胞的基因進行編輯，成功治癒一歲小女孩Layla的白血病。
3、CRISPR/Cas技術：能夠同時編輯多個基因，靶向效率高CRISPR/Cas系統是一種由RNA介導的，可遺傳的有效的獲得性免疫機制，存在於約40%的細菌和90%的古細菌中，該系統主要是細菌為抵抗噬菌體或質粒所帶來外源DNA片段的入侵的免疫系統。
CRISPR重複序列家族的結構通常由一個前導區(Leader)、重複序列區(Repeat) 和間隔區(Spacer)所組成，Leader區是一段長約300~500 bp左右富含AT鹼基的DNA序列，其位於CRISPR基因簇上遊，該區段序列在同一物種內相對保守，但在不同物種之間差距很大。Repeat區是一段長約24~48 bp的序列相對保守的迴文序列，該序列打開後能形成髮夾狀結構。Repeat區序列並不連續，中間被長度約為26~72 bp的Spacer區所分隔，Spacer區序列與一些噬菌體和質粒的序列存在一定程度的同源性，使該系統能夠特異性地識別一些噬菌體和質粒從而抵抗外源基因的侵染。當噬菌體入侵細菌的起始階段，Cas蛋白複合物與噬菌體中相應的原型間隔序列(proto-spacer)相結合併裂解相關序列，裂解後的proto-spacer序列整合到CRISPR位點的重複序列之間，隨即被轉錄成為crRNA(CRISPR RNA)，並且crRNA的兩側還保留有部分Repeat序列。當宿主再次被噬菌體侵染時，crRNA能夠識別噬菌體的proto-spacer序列並將其降解，而CRISPR序列中由於沒有原型間隔序列毗鄰區(PAM)，因此不會被降解。
根據Cas基因核心序列的不同，CRISPR/Cas系統可以分為3種不同的類型：Ⅰ型(TypeⅠ)、Ⅱ型(Type Ⅱ)和Ⅲ型(Type Ⅲ)。Ⅰ型與Ⅲ型系統的作用機制相類似，Ⅰ型CRISPR/Cas系統以Cas3基因編碼的蛋白為核心，Cas3蛋白具有解旋酶和核酸酶的作用，而Ⅲ型CRISPR/Cas系統以Cas6蛋白為核心。在效應階段，多個Cas基因表達的蛋白形成Cascade複合體，該複合體將前體crRNA加工成成熟的crRNA並與之結合，同時tracrRNA(trans-activating RNA)與crRNA形成雙鏈二級結構，用以招募Cas蛋白。在Cascade、crRNA與Cas所組成的三元複合體的作用下，靶DNA被降解。Ⅱ型CRISPR/Cas系統與Ⅰ型和Ⅲ型系統的不同之處在於，Ⅱ型系統只需要Cas9、crRNA、反式激活crRNA(trans-encoded small RNA, tracrRNA)及RNase III的作用，便可以使靶DNA降解。目前，由於Ⅱ型系統與其餘兩種系統相比操作更為簡便，現在常用的基因組編輯系統為Ⅱ型CRISPR/Cas系統，即CRISPR/Cas9系統。
在CRISPR/Cas9系統中，Cas9基因編碼的蛋白具有解旋酶活性，為該系統中的關鍵蛋白，其主要包含有HNH和RuvC兩個活性位點。在反應初始階段pre-crRNA轉錄被出來，Cas9蛋白與RNase III對其進行加工形成成熟的crRNA，隨後crRNA、Cas9與轉錄出來的tracrRNA結合形成複合體，該複合體識別並解開與crRNA互補的靶DNA序列，緊接著crRNA與互補的DNA鏈雜交，隨後Cas9蛋白的HNH活性位點開始切割互補的DNA鏈，RuvC活性位點切割另一條游離的DNA鏈，從而使dsDNA斷裂，從而啟動細胞內的HR或NHEJ機制，實現對靶基因組的編輯。在實際應用中發現，為了避免NHEJ的發生，可以將RuvC或HNH活性位點進行突變，突變後的Cas9（Ruv-、HNH-）突變體只有切割單鏈的活性，從而更容易達到打靶的目的。
由於其能夠製造單鏈切口的特點，使得發生NHEJ的風險大大降低，編輯的效率提高；操作簡單，構建成本低，可以希望用於基因治療；而許多人類複雜疾病也確是由於多個位點的單基因突變組合引發的，CRISPR系統最大優勢在於由於其靶位點長度在20 bp左右，因此可以通過將多個sgRNA串聯在一起，從而同時實現對多個基因的編輯；基因組編輯技術雖都存在脫靶風險，但相比ZFN和TALEN，CRISPR技術的靶向效率更高，因為其靶向原理是依賴於核酸之間（RNA與DNA）的鹼基配對。
II型CRISPR-Cas系統一般構建流程：（1）設計針對目標基因序列的sgRNAs;
（2）構建能表達Cas9蛋白和sgRNA的表達質粒；
（3）轉染進入靶細胞；並篩選出轉染成功的細胞（可選）
（4）擴增陽性克隆，篩選出CRISPR成功誘導出突變的陽性突變體。
三、基因編輯技術應用相關疾病研究取得重大進展 1、基因組編輯技術應用廣泛，助力相關疾病研究基因組編輯技術作為一種在功能基因組學研究中被廣泛應用的方法，因其能夠減弱甚至完全阻斷目的基因的表達的特點，從而可以通過研究生物體所發生的變化推斷該基因的功能。目前，已經在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、小鼠等多種模式生物中實現了目的基因組DNA的編輯，基因組編輯技術為這些模式生物中功能基因的研究做出了貢獻。
基因組編輯技術也常被用於建立特定基因缺失的動物模型，如人類疾病動物模型等。目前，通過基因組編輯技術建立了多種疾病動物模型，為相關疾病的研究打下了基礎。
以及在上文中提到的兩例臨床成功案例：利用鋅指酶技術敲除愛滋患者血液T細胞或者CD4造血幹細胞中的愛滋病毒受體CCR5，從而治療愛滋病，以及英國倫敦大奧蒙德街兒童醫院免疫學家Waseem Qasim 利用TALENs技術對從健康捐獻者血液中分離的T淋巴細胞的基因進行編輯，成功治癒一歲小女孩Layla的白血病。
2、CRISPR技術嘗試用於體內肝臟細胞，用來預防心血管疾病我國科學家丁秋蓉研究員結合TALENs和CRISPR基因編輯技術，利用病人誘導性多能幹細胞，通過精確引入病人基因突變，建立了多種代謝疾病模型用於高通量「個性化」藥物篩選。並且其領先將CRISPR技術直接用於體內肝臟細胞基因編輯，首次證明可以通過體內特異靶向敲除PCSK9基因來防治心血管疾病的新基因治療方案。研究成果在2014年發表在心血管領域權威雜誌Circulation Research上，被美國心血管學會選為2014年心血管領域十大進展。
今年在劍橋舉行的EmTech會議上，Editas公司CEO Katrine Bosley 表示，該公司計劃在2017年開啟CRISPR治療失明的臨床試驗。如果Editas執行該計劃，那麼這項研究將是CRISPR編輯人類DNA的首個例子。
四、未來機遇與挑戰並存，前景看好基因組編輯技術未來的發展趨勢有：與幹細胞結合構建疾病模型，編輯幹細胞基因製備治療性幹細胞，編輯免疫細胞基因製備治療性免疫細胞，深入解析人類基因組學信息，開發CRISPR基因編輯技術為新的基因治療方案。
但是基因組編輯技術也面臨一定的發展障礙，如何進行體內的高效特異安全運輸成為CRISPR用於體內基因治療的一大瓶頸。因此尋找高效、特異、安全的體內運輸方式，並且同時全面評估CRISPR系統體內編輯的脫靶率和長期安全性將直接決定該技術平臺是否能真正用於臨床基因治療。
五、投資建議精準醫療從前端的基因測序到後端的免疫細胞治療以及基因編輯等新技術，當前時點，精準醫療板塊我們建議關注香雪製藥，勁嘉股份，北陸藥業，澳洋科技，姚記撲克，達安基因，迪安診斷，新開源，安科生物，榮之聯，中源協和等。
國內外涉及基因組編輯技術的公司有Intellia Therapeutics公司、CRISPR Therapeutics公司，Editas公司等，國內目前設計基因編輯的上市公司主要有勁嘉股份(SZ.002191)和澳洋科技（SZ.002172）。
勁嘉股份是一家商業印刷企業，公司於12月15日與中山大學抗衰老研究中心籤署戰略合作意向書，雙方將在「基因編輯與細胞治療」等生物技術領域開展合作，協議有效期至2020年末。大健康產業作為公司未來五年發展戰略的核心產業之一，本次戰略合作將圍繞健康衰老、基因編輯、細胞治療等生物技術等方面開展，是對公司大健康產業初步布局。
澳洋科技2015年11月12日公告聲稱：公司擬出資人民幣2,000萬元對吉凱基因進行增資,增資完成後,公司持有其2%股權。吉凱基因提供CRISPR/Cas9慢病毒, 基因編輯大小鼠等技術服務。
六、風險提示研發失敗以及政策變化
（責任編輯：李治華 HN026）