CRISPR自由編輯DNA「生命之書」 下一個精準醫療風口

CRISPR/Cas9基因組編輯技術給整個學術界和工業界帶來了革命性的變化，有數以千計的實驗室在用該技術進行生物科學研究，然而關於該系統的一些基礎性問題卻依然是個謎團，引人深思。

CRISPR簡介

CRISPR/Cas9 (Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)技術是近十幾年發展的一種準確、高效率、便捷的生物基因編輯技術，已經成為一種非常熱門的基因組編輯工具。CRISPR即有規律的、成簇的、短間隔回文重複序列，它原本是存在於細菌和古

細菌

基因組中含有多個短重複序列的基因位點，能夠為機體提供一種特異性免疫保護機制，抵抗外來質粒、病毒等

遺傳

物質的入侵，其主要依賴的是Cas9核心蛋白，在RNA的介導下，Cas9蛋白能夠識別目標序列進行切割造成DNA的雙鏈斷裂。該基因編輯系統僅需要短的gRNA (guide RNA)和核酸酶(Cas9)就可以實現對特定的生物靶基因進行定點突變；該技術的快速發展，為生物基因編輯技術的發展注入了新的活力。

CRISPR技術起源自哪裡？

CRISPR系統的生物學優勢非常明顯。原核生物（細菌等）以及生活在極端環境中的不知名單細胞生物（如古細菌）面臨著入侵者外源核酸的持續攻擊。病毒的數量以10：1的比例遠超過原核生物，根據推算每兩天病毒就可以殺死世界上一半的

細菌

。原核生物還可通過質粒來交換DNA片段，一旦交換的DNA 能「綁架」宿主菌中生長過程的關鍵分子來維持自身穩定時，則該質粒具有使宿主菌致病的能力。

然而原核生物也進化出了一系列應對外源基因侵襲的「生化武器」。比如，限制性內切酶就是一種能在靠近DNA特定序列位點進行切割的蛋白酶。但是這種防禦功能非常遲鈍，因為每種內切酶只能靶向切割特定的基因序列。而動態的CRISPR/Cas系統卻更加靈活，因為它會採取類似感染時抗體發揮長期免疫作用的機制，對入侵的外源性核酸進行及時的免疫應答和免疫記憶。

Mojica等研究者在觀察到了CRISPR系統中的回文重複序列有時能與病毒基因組序列相匹配後，便對CRISPR/Cas的功能進行了深一步的研究。研究發現當細菌和古

細菌

暴露於特定的病毒或質粒時，某些特定的Cas蛋白可以把一些間隔序列添加至基因組中。然後由這些間隔序列轉錄的RNA引導其他Cas蛋白靶向任何能匹配間隔序列的外源性DNA/RNA並對其進行切割。

至於細菌和古

細菌

為何能擁用如此複雜的免疫系統，至今還沒有得到解答。但是目前主流理論認為CRISPR系統來自於「跳躍的基因」——轉座子（Transposon），可以從基因組的一個位置轉移到另一個位置。美國國家衛生研究院的進化生物學家Eugene Koonin和他的同事發現了一類可編碼Cas1蛋白的移動基因，Cas1能將間隔序列插入基因組中。他們認為這些「Transposon」可能就是CRISPR/Cas免疫系統的起源。目前研究者正在對這些DNA轉座子的轉移過程及追蹤機制進行深入研究，並希望以此來揭示CRISPR/Cas系統的複雜性。

CRISPR-Cas系統作為新型基因編輯技術的原理

細菌和古生菌由於長期生存在充滿噬菌體、質粒或者其他病毒的大自然環境裡，在長期與這些病毒生存的抗爭中，其進化演變出了很多種防禦系統，CRISPR/Cas系統便是其中最有效的防禦系統之一。CRISPR/Cas系統的機制比較複雜，目前還未能完全明白整個過程，大致可分三個階段：a.新spacer的獲得；b.CRISPR RNA的合成；c.靶點的幹擾。第一階段即將外源入侵的噬菌體或質粒中的小段DNA序列插入整合到自身的基因組內，這一小段外源DNA被插入到兩個repeat之間。而該系統識別外源與自身DNA序列的一個標識是PAM序列(Protospacer Adjacent Motif)，—般為NGG，位於外源序列的3'端。CRISPR RNA的合成是一個複雜的生化過程，己知在typeII CRISPR系統中tracrRNA與pre-crRNA的repeat結合成一個二元複合物，然後作為底物被typeII CRISPR系統切割，還有Cas9的參與，隨後經另一種核酸酶修飾切掉5'端的其它repeat。第三個階段crRNA與Cas蛋白結合形成CRISPR核糖核蛋白複合物，進而識別外源入侵的鹼基序列。簡單來說，CRISPR/Cas9系統以外源入侵的核酸序列(spacers)為模板，合成小分子的RNA(crRNA)，然後crRNA與Cas蛋白結合成效應複合體來沉默以後入侵的外源鹼基序列。現在已經清楚，CRISPR/Cas系統是存在於細菌和古細菌內的一種獲得性免疫體系。藉助於這一系統，細菌和古

細菌

可以將外源入侵的噬菌體或質粒的DNA存儲到系統內，作為一種"記憶"，待下次入侵時發揮免疫作用，達到保護自身的目的。對於CRISPR/Cas系統的工作機理，目前還沒有徹底研究清楚，許多作用細節還未知，並且不同類型系統的機理也有差別。而其中Type ll作為結構最簡單的類型，已經被研究者們改造為強大的基因編輯工具，現在已經成為生物研究領域有力的基因編輯方法和手段。

CRISPR應用範圍

在科研領域，CRISPR/Cas可以幫助構建模式生物，通過基因工程手段在多種模式生物中構建疾病樣本，幫助人類疾病研究。目前已經實現了利用CRISPR/Cas 技術對傳統模式生物，如線蟲、斑馬魚、果蠅等進行

遺傳

學改造，另外在狗、山羊、猴、豬等動物中也已經被證實是有效的。

在農業領域，CRISPR/Cas可以加速對植物基因組的改造，提高農作物產量、加強農作物抗病能力。在中國耕地面積稀缺的大背景下，改良農作物的需求尤為急迫。

在遺傳病治療領域，CRISPR/Cas的高精確度、低脫靶率大大提高了通過改造體細胞基因以緩解甚至治癒

遺傳

病的可能。目前已有科研報告顯示，CRISPR/Cas技術的應用治癒了患有酪氨酸血症的成年小鼠。在細胞層面，CRISPR/Cas技術實現矯正

ips

細胞中導致β-地中海

貧血

症的HBB突發。

在傳染病治療領域，CRISPR/Cas的應用更為直觀。CRISPR/Cas系統切除人體細胞中的外來病毒基因並滅活病毒，這一過程和

細菌

體內的免疫過程類似，只需要精確切除目標序列而無需引入其他基因序列。科研實驗已經證明CRISPR/Cas系統對HIV病毒及HBV病毒在細胞層面的有效抑制。

在癌症治療領域，CRISPR/Cas可以幫助CAR-T細胞治療提供更有效更廣泛的應用。CRISPR/Cas的精準定位可以解決目前CAR-T療法由於插入位點隨機引起的安全性問題，另外也可以用於定位敲出健康人T細胞的個體化相關基因以將其引入患者體內進行治療，或者在患者體內定向敲除免疫排斥反應相關基因以達到異體治療的目的。目前已有報導使用TALEN技術編輯CAR-T細胞治癒了一名患有耐藥性

白血病

的小女孩。藉助更加精確、高效的CRISPR/Cas技術，CAR-T細胞治療方法的前景將更值得期待。

2016.11.15 Nature主頁報導全球首個CRISPR技術的人體應用已在中國啟動，10 月 28 日首名非小細胞肺癌患者接受了經CRISPR技術改造的T細胞的治療，四川大學華西醫院盧鈾團隊採取以下技術路徑將CRISPR/Cas9用於非小細胞肺癌患者的治療；從招募的患者體內分離出 T細胞，並利用 CRISPR技術對這些細胞進行基因編輯，敲除這些細胞中抑制免疫功能的PD-1基因，並在體外進行細胞擴增。當細胞達到一定量後，將它們輸回患者體內對

腫瘤

進行殺傷。在7月 6 日獲得華西醫院倫理委員會批准後 ，10 月 28 日首名非小細胞肺癌患者已經接受了經 CRISPR技術改造的 T細胞的治療，目前盧鈾 小組表示治療實驗進展順利。全球首個CRISPR

臨床試驗

順利在中國推進將對國內精準醫療領域形成強有力催化，國內精準醫療投資迎來投資風口。

CRISPR受到資本市場的追捧

CRISPR技術自2012年被應用以來受到了廣泛的關注，並且發展迅速。美國已有數家CRISPR技術公司成立並吸引了大量投資。其中由CRISPR技術發明人之一張峰創始的Editas Medicine已於2016年2月8日於紐交所通過IPO成功融資9440萬美元。

A股投資標的篩選

結合CRISPR技術、臨床進展、適應症和靶點，重點關注具備技術領先優勢的企業。

銀河生物(000806)

2015年5月發布公告，斥資5億元以增資併購方式取得投資標的南京生物的90%股份。南京生物是南京大學生物醫藥研究院和南京大學模式動物研究所的產業化平臺，在利用各種基因編輯技術製作轉基因模式動物上具有領先的技術和經驗。未來將啟動模式動物全球銷售渠道建設，和

腫瘤

免疫治療藥物篩選和檢測平臺、轉基因小鼠人源化平臺建設以及基於平臺所開發、引進創新型大分子藥物產業化(含治療肺癌、

肝癌

、淋巴瘤、肝硬化、

帕金森氏症

以及類風溼關節炎等疾病的新型藥物)，為上市公司布局精準醫療產業鏈奠定基礎。

東富龍(300171)

增資9000萬元獲得上海伯豪生物技術有限公司34.0206%的股權，成為伯豪生物第一大股東。伯豪生物的主營業務為生物CRO技術服務業務，可提供基因組編輯技術CRISPR/Cas9技術定製服務，已完成胃癌、肺癌、Hela、293T、

肝癌

等細胞的建系、20多種

腫瘤

細胞系CRISPR/Cas9測試、15個Gene的敲除和2個

miRNA

的刪除等。2015年12月31日，公司發布公告擬投資不低於1億元設立重慶精準醫療產業技術研究院，未來東富龍醫療將逐步建立基因測序、分子

診斷

、細胞治療三大平臺，打造精準醫療研、產、銷為一體的大生態系統。

澳洋科技（002172）

2015年12月公告參股2%吉凱基因。吉凱基因已完成1億元B輪融資，具備CAR-T和CRISPR/Cas9 技術，有望成為國內首個開發2.0版CAR-T的公司。

安科生物（300009）

和蘇州博生吉合作推進CAR-T療法。博生吉是國內首家擁有CAR-T細胞/CAR-NK細胞技術服務平臺的公司，採用最先進的CRISPR/Cas9基因編輯技術進行處理。已成功構建第二代、第三代和第四代CAR-T系統，具備MUC1靶點的實體瘤CAR-T療法。2015年11月份和武警安徽/浙江總院開展實體

腫瘤

CAR-T

臨床試驗

，目前在志願者徵集過程。

恆瑞醫藥（600276）

與深圳源正細胞醫療技術有限公司合資成立恆瑞源正生物科技有限公司。源正細胞醫療技術有限公司目前正在研發CAR-T 細胞技術，儲備有近二十個靶點；2013 年起在中國開展細胞治療隨機對照的多中心臨床試驗，具備細胞治療

臨床試驗

經驗。

相關會議推薦

2017模式動物與重大疾病動物模型研究與應用研討會

會議時間：2017.3.24 -3.25      會議地點：上海

會議詳情： http://www.bioon.com/z/2017model_organism/