2019年4月30日訊/生物谷BIOON/---基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜誌列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短回文重複序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是
細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。
圖片來自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。
2018年11月26日，中國科學家賀建奎聲稱世界上首批經過基因編輯的嬰兒---一對雙胞胎女性嬰兒---在11月出生。他利用一種強大的基因編輯工具CRISPR-Cas9對這對雙胞胎的一個基因進行修改，使得她們出生後就能夠天然地抵抗HIV感染。這也是世界首例免疫愛滋病基因編輯嬰兒。這條消息瞬間在國內外網站上迅速發酵，引發千層浪。有部分科學家支持賀建奎的研究，但是更多的是質疑，甚至是譴責。
即將過去的4月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發現呢？小編梳理了一下這個月生物谷報導的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閱讀。
1.Nature：開發出Cas9-MMEJ可編程基因編輯方法，有望治療143種由DNA微重複引起的疾病在一項新的研究中，來自美國麻薩諸塞大學醫學院的研究人員開發出一種利用CRISPR-Cas9和一種很少使用的DNA修復途徑編輯和修復一種特定類型的與微重複（microduplication）相關的基因突變。這種可編程基因編輯方法克服了之前在基因校正中所遭遇的低效率。相關研究結果於2019年4月3日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「Precise therapeutic gene correction by a simple nuclease-induced double-stranded break」。
微重複是染色體發生變化而使得 DNA上的小片段被拷貝或複製。在某些基因中，當添加的核苷酸數量不能被3整除時，這些微重複就能夠導致所謂的「移碼突變」。這改變了基因向蛋白的翻譯，從而導致功能喪失。由微重複引起的移碼突變導致多達143種不同的疾病，包括肢帶肌營養不良（limb-girdle muscular dystrophy）、赫曼斯基-普德拉克症候群（Hermansky-Pudlak syndrome）和家族黑蒙性白痴病（Tay-Sachs）。
論文共同通訊作者、麻薩諸塞大學醫學院分子、細胞與癌症生物學教授Scot A. Wolfe博士和論文共同通訊作者、麻薩諸塞大學醫學院威爾斯通肌肉營養不良中心主任、神經學教授Charles P Emerson Jr.博士認為可能存在更為直接的方法來校正由微重複引起的疾病。他們推斷如果微同源介導的末端連接（microhomology-mediated end joining, MMEJ）途徑可以被有效利用，而不是利用同源介導修復途徑，它將會移除重複序列並恢復基因的功能序列。
Emerson博士有一個很有希望的疾病目標，用於評估這種編輯方法的可行性---由TCAP基因中的微重複引起的2G型肢帶肌營養不良（LGMD2G）。Emerson實驗室和Wolfe實驗室構建的釀膿鏈球菌Cas9核酸酶（Strestococcus pyogenes Cas9, SpCas9）靶向TCAP基因的微重複中心附近的DNA斷裂。他們接著利用SpCas9處理了源自LGMD2G患者的多能性幹細胞。正如他們預測的那樣，MMEJ修復機制移除了這種微重複的一個拷貝---有效地將DNA重新拼接在一起，拼接效率非常高，因而去除了突變的遺傳物質並讓這個基因得到恢復，從而能夠產生正常的TCAP蛋白。
2.Science子刊：我國科學家開發出一種可遠程控制的基因編輯平臺在一項新的研究中，來自中國南京大學、南京工業大學和廈門大學的研究人員開發出利用病毒將CRISPR-Cas9基因編輯工具運送到特定細胞中的一種替代載體，它涉及使用兩種類型的光。相關研究結果發表在2019年4月3日的Science Advances期刊上，論文標題為「Near-infrared upconversion–activated CRISPR-Cas9 system: A remote-controlled gene editing platform」。在這篇論文中，他們描述了他們的新型載體以及它在試驗用小鼠中的效果。論文通訊作者為南京大學的宋玉君（Yujun Song）教授、南京工業大學的王玉珍（Yuzhen Wang）副研究員和廈門大學的林友輝（Youhui Lin）副教授。
圖片來自Science Advances (2019). DOI: 10.1126/sciadv.aav7199。
這種載體系統由對低能近紅外輻射（NIR）敏感並發出紫外光的上轉換納米顆粒（upconversion nanoparticle, UCNP）組成。當近紅外光照射在這些上轉換納米顆粒上時，這種光被吸收並轉換成紫外光，所產生的紫外光會發射出去。在細胞內部，這種載體系統可通過給皮膚照射近紅外光加以激活。照射的近紅外光穿過皮膚進入體內，並前去尋找這種載體系統。當近紅外光被上轉換納米顆粒轉化為紫外光時，它切割這種載體系統中的分子，從而釋放出這種基因編輯工具來完成它的作用。
在實際的實驗中，這些研究人員通過注射將CRISPR-Cas9工具直接遞送至小鼠內部的癌性腫瘤中。當它安全就位時，他們將近紅外光照射到位於腫瘤（和基因編輯工具）所在部位上方的皮膚上。當所產生的紫外光釋放出這種基因編輯工具時，它開始編輯一種允許腫瘤生長的蛋白，最終結果就是腫瘤尺寸減小。
3.Science子刊重大突破！首次利用CRISPR技術實現子宮內胎兒遺傳疾病治療費城兒童醫院(CHOP)和賓夕法尼亞醫學院的一個研究小組利用CRISPR基因編輯技術，在一種動物模型中成功地阻止了一種致命的肺部疾病。這種動物模型中，一種有害的突變會導致幼體出生後幾小時內死亡，相關研究成果於近日發表在《Science TranslationalMedicine》上，這項概念驗證性研究表明，子宮內編輯可能是一種在出生前治療肺部疾病的很有前途的治療新方法。
研究人員發現，在胎兒發育過程中，準確地向羊水中注入CRISPR基因編輯器可導致小鼠肺部發生有針對性的變化。他們在老鼠出生前4天將基因編輯器引入老鼠體內，這與人類的妊娠晚期相似。研究結果發現編輯率最高的細胞為肺泡上皮細胞和排列在肺氣道內的氣道分泌細胞。
在第二個實驗中，研究人員使用產前基因編輯技術，在小鼠模型中降低了肺間質疾病——表面活性蛋白C (SFTPC)缺陷的嚴重程度。未經治療的攜帶這種突變的小鼠在出生後數小時內全部死於呼吸衰竭。相比之下，產前基因編輯使突變的Sftpc基因失活，可以使超過22%的動物的肺形態和存活率得到改善。未來的研究將致力於提高肺上皮組織基因編輯的效率，以及評估將基因編輯技術傳遞給肺的不同機制。
4.Nature：震驚！CRISPR鹼基編輯器能夠誘導大量的脫靶RNA編輯在一項新的研究中，來自美國麻省總醫院、哈佛醫學院和哈佛大學陳曾熙公共衛生學院的研究人員報導近期開發的幾種在單個DNA鹼基中產生靶向變化的鹼基編輯器能夠在RNA中誘導廣泛的脫靶效應。他們還描述了對鹼基編輯器變體進行基因改造可顯著降低RNA編輯的發生率，這同時也會增加在靶DNA編輯的精確度。相關研究結果於2019年4月17日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors」。
論文通訊作者、麻省總醫院病理學系的J. Keith Joung博士說道，「大多數關於脫靶基因編輯的研究都集中在DNA上，但是我們發現這種技術也可以誘導大量的RNA改變。這一令人吃驚的發現表明，當考慮鹼基編輯器在細胞中的不想要的脫靶效應時，需要考慮的不僅僅是基因變化。我們還發現構建選擇性地降低脫靶RNA編輯同時保留想要的在靶DNA編輯的變體來減少這些影響是可行的。」
為了研究減少或消除不需要的RNA編輯的可能性，Joung團隊篩選了16種具有脫氨酶改造版本的鹼基編輯器（即鹼基編輯器改造版本），從中鑑定出兩種鹼基編輯器改造版本與它們的原始版本同樣高效地誘導在靶DNA編輯，同時誘導顯著少的RNA編輯。實際上，這些SECURE（SElective Curbing of Unwanted RNA Editing, 選擇性抑制不需要的RNA編輯）變體甚至要比未經基因改造的脫氨酶更精確地誘導所需的DNA編輯。
5.Nat Biotechnol：讓gRNA形成髮夾結構可提高CRISPR系統的準確性，提高50倍在一項新的研究中，來自美國杜克大學的研究人員開發出一種方法，可將CRISPR基因組編輯技術的準確性平均提高50倍。他們認為它可以很容易地擴展到這種基因編輯技術的不斷擴大的其他形式。這種方法給用於識別待編輯的DNA序列的嚮導RNA（gRNA）添加一條短尾巴。這條增加的尾巴摺疊回來進行自我結合，從而產生一把僅由靶DNA序列打開的「鎖」。相關研究結果於2019年4月15日在線發表在Nature Biotechnology期刊上，論文標題為「Increasing the specificity of CRISPR systems with engineered RNA secondarystructures」。
圖片來自Ella Maru。
接下來，這些研究人員希望看到這種方法可以處理多少種不同的CRISPR變體，並對這種上鎖機制的工作原理進行深入的描述，以便觀察不同CRISPR變體之間是否存在差異。鑑於這些實驗是在體外培養的細胞中進行的，他們迫切希望看到這種方法在實際的動物疾病模型中如何可能提高CRISPR的準確性。
6.JEM：利用CRISPR/Cas9對B細胞進行基因編輯有望開發出HIV疫苗人體不能自然地保護自己免受HIV病毒感染---至少通常不能做到這一點。但是，在極少數情況下，受感染的個體會產生對抗這種病毒的廣泛中和抗體（bNAb）。如今，在一項新的研究中，來自美國洛克菲勒大學的研究人員設計出一種方法，將這種對抗HIV的能力賦予給普通的免疫細胞。相關研究結果於2019年4月11日在線發表在Journal of Experimental Medicine期刊上，論文標題為「HIV-specific humoral immune responses by CRISPR/Cas9-edited B cells」。論文通訊作者為洛克菲勒大學的Michel C. Nussenzweig博士。Nussenzweig和他的同事們使用CRISPR-Cas9基因編輯技術來修飾B細胞，即一種分泌抗體的白細胞。具體而言，他們對小鼠B細胞進行基因改造，使得它們自己產生人bNAb。他們發現，以這種方式發生改變的B細胞產生的抗體水平足以保護小鼠免受HIV感染，這表明這種技術最終可能用作一種免疫工具。
雖然這項研究仍處於早期階段，但是它證實了通過基因編輯增強免疫應答的可行性。重要的是，這種技術不會影響生殖細胞，因而避免了有時由CRISPR幹預引起的倫理問題。如果能夠實現，這種新的免疫方法不僅可以用於治療HIV感染，而且還可以用於治療任何對特定抗體敏感的疾病。
7.Science：開發出一種檢測CRISPR脫靶效應的新方法---DISCOVER-Seq自從CRISPR基因組編輯技術於2012年發明以來，它已經顯示出治療許多難治性疾病的巨大希望。然而，科學家們一直在努力在治療相關的細胞類型中鑑定潛在的脫靶效應，這仍然是將治療方法轉移到臨床應用的主要障礙。如今，在一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校、加州大學舊金山分校、格拉德斯通研究所和瑞典阿斯利康公司的研究人員開發出一種可靠的方法來實現這一目標。相關研究結果發表在2019年4月19日的Science期刊上，論文標題為「Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq」。論文通訊作者為加州大學伯克利分校的Jacob E. Corn。論文第一作者為加州大學伯克利分校的Beeke Wienert和Stacia Wyman。
CRISPR通過在特定位置切割DNA來編輯人的基因組。所面臨的挑戰是確保這種工具不會在其他地方進行切割，即一種被稱為「脫靶效應」的DNA損傷，這可能會帶來無法預料的後果。Wienert博士說，「當CRISPR進行切割時，DNA會被破壞。因此，為了生存，細胞將許多不同的DNA修復因子募集到基因組中的特定位點上以修復斷裂並將切割末端連接在一起。我們認為如果我們能夠找到這些DNA修復因子的位置，我們就可以鑑定出被CRISPR切割的位點。」
為了測試這種想法，這些研究人員研究了一組不同的DNA修復因子。他們發現其中的一種稱為MRE11的DNA修復因子是DNA切割位點的第一批響應者之一。他們利用MRE11開發了一種名為DISCOVER-Seq的新技術，它可以識別出CRISPR切割基因組的確切位點。
Corn說，「鑑於我們的方法依賴於細胞的自然修復過程來識別切割位點，它經證實是一種侵入性更小、更可靠的方法。我們能夠在誘導性多能幹細胞、患者細胞和小鼠中測試我們新開發的DISCOVER-Seq方法，而且我們的研究結果表明這種方法可潛在地用於任何系統，而不僅僅是在實驗室中。」
8.PNAS：在人細胞中構建出一種強大的基於CRISPR/Cas9的雙核CPU在一項新的研究中，來自瑞士蘇黎世聯邦理工學院的研究人員將兩個基於CRISPR-Cas9的核心處理器整合到人體細胞中，這代表了在構建強大的生物計算機方面邁出了重要的一步。相關研究結果發表在2019年4月9日的PNAS期刊上，論文標題為「A CRISPR/Cas9-basedcentral processing unit to program complex logic computation in human cells」。論文通訊作者為蘇黎世聯邦理工學院生物系統科學與工程系生物技術與生物工程教授Martin Fussenegger。
圖片來自Colourbox/Steven Emmett, ETH Zurich。
Fussenegger及其團隊利用生物組分構建一種靈活的稱為中央處理單元（CPU）的核心處理器，它接受不同類型的編程。他們開發出的這種處理器基於經過基因修飾的CRISPR-Cas9系統，並且基本上能夠以RNA分子（稱為嚮導RNA）的形式接受所需數量的輸入。
Cas9蛋白的一種特殊變體構成了這種處理器的核心。通過對由嚮導RNA（gRNA）序列遞送的輸入作出反應，CPU調節特定基因的表達，這個基因接著產生特定的蛋白。通過這種方法，這些研究人員能夠對人體細胞中的可擴展電路進行編程---就像數字半加法器那樣，它們由兩個輸入和兩個輸出組成，並且能夠執行兩個單位二進位數的加法運算。
9.Nature子刊：開發出可在幾分鐘內檢測基因突變的CRISPR晶片在一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校和克萊蒙特學院聯盟凱克研究所的研究人員將CRISPR與用石墨烯製成的電子電晶體結合在一起，構建出一種可在幾分鐘內檢測出特定基因突變的新型手持設備。這種稱為CRISPR-Chip（CRISPR晶片）的設備可用於快速診斷遺傳疾病或評估基因編輯技術的準確性。他們使用這種設備來鑑定來自杜興氏肌營養不良（DMD）患者的DNA樣品中的基因突變。相關研究結果於2019年3月25日在線發表在Nature Biomedical Engineering期刊上，論文標題為「Detection of unamplified target genesvia CRISPR–Cas9 immobilized on a graphene field-effect transistor」。
論文通訊作者、克萊蒙特學院聯盟凱克研究所助理教授Kiana Aran說道，「我們開發出首個利用CRISPR在基因組中搜索潛在突變的電晶體。僅需將純化的DNA樣品放在這種晶片上，讓CRISPR進行這種搜索，這種石墨烯電晶體可在幾分鐘內報告搜索結果。」
但是與大多數形式的基因檢測---包括近期開發的基於CRISPR的診斷技術---不同的是， CRISPR-Chip使用納米電子技術來檢測DNA樣本中的基因突變，而無需首先通過一種稱為聚合酶鏈式反應（PCR）的時間和設備密集型過程來對感興趣的DNA片段進行數百萬次「擴增」或著說複製。這意味著它可能用於在醫生辦公室或野外工作環境中進行基因檢測，而無需將樣品送到實驗室。
10.Blood：利用CRISPR-Cas12a基因編輯有望治療β-地中海貧血根據世界衛生組織（WHO）的統計，鐮狀細胞病和β-地中海貧血每年在世界範圍內共影響33.2萬人懷孕或分娩。這兩種疾病都涉及β珠蛋白編碼基因發生突變。在β-地中海貧血中，突變阻止紅細胞產生足夠多的攜氧血紅蛋白分子，從而導致貧血。在鐮狀細胞病中，突變導致血紅蛋白改變形狀，使得紅細胞變形為僵硬的「鐮刀」形狀，從而阻塞血管。
在一項新的研究中，來自美國達納法伯癌症研究所、波士頓兒童醫院和麻薩諸塞大學醫學院等研究機構的研究人員通過將CRISPR-Cas12a基因編輯應用於患者自己的造血幹細胞中，開發出一種治療一種最為常見的遺傳性血液疾病---β-地中海貧血---的策略。這種方法克服了之前的技術挑戰，而且要比過去更有效地對造血幹細胞進行編輯。相關研究結果近期發表在Blood期刊上，論文標題為「Editing aberrant splice sites efficiently restores β-globin expression in β-thalassemia」。論文第一作者為Shuqian Xu。論文通訊作者為Daniel Bauer博士和Scot Wolfe博士。
這新的研究發現這些經過基因編輯的造血幹細胞產生得到基因校正的紅細胞，因而能夠產生功能性的血紅蛋白。
在這項新的研究中，這些研究人員使用一種類似於CRISPR-Cas9的基因編輯方案來靶向涉及剪接突變---在β-珠蛋白編碼基因附近的DNA片段出現差錯改變讀取這個基因以組裝β-珠蛋白的方式---的β-地中海貧血形式。9名β地中海貧血患者捐獻了他們的造血幹細胞，這樣就可在培養皿中操縱它們。對於其中的一些患者，這些研究人員利用另一種不同的酶--- Cas12a---來更高效地靶向這些突變。CRISPR/Cas12a高效地進行基因編輯並恢復了來自每名患者的血細胞中β-珠蛋白編碼基因的正常剪接。（生物谷 Bioon.com）