2017年6月28日/生物谷BIOON/---基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜誌列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短回文重複序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。
即將過去的6月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發現呢？小編梳理了一下這個月生物谷報導的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閱讀。
1.JCI：CRISPR/Cas9基因編輯技術有望治療亨廷頓舞蹈症doi:10.1172/JCI92087圖片來自Journal of Clinical Investigation, doi:10.1172/JCI92087
亨丁頓舞蹈症（Huntington's disease, HD）是一種遺傳性神經退行性疾病。破壞腦細胞中的一種有問題的基因能夠逆轉亨丁頓舞蹈症病理和運動症狀。 亨丁頓舞蹈症是由編碼一種被稱作突變的亨廷頓蛋白（mutant huntingtin, mHTT）的毒性蛋白的基因導致的。mHTT蛋白在腦細胞中形成聚集物，從而導致腦細胞死亡。它的症狀通常在中年時出現，包括不受控制的運動、平衡問題、情緒波動和認知下降。
在一項新的研究中，來自美國埃默裡大學醫學院、中國科學院和暨南大學的研究人員在在9個月大的亨丁頓舞蹈症模式小鼠中利用通過一種病毒載體運送的CRISPR/Cas9切除它們的腦細胞中的mHTT基因的一部分。幾周後，在大腦中接受這種病毒載體注射的地方，這些蛋白聚集物幾乎消失了。此外，這些小鼠的運動能力得到改善，不過沒有恢復到健康小鼠的水平。相關研究結果於2017年6月19日首次發表在Journal of Clinical Investigation期刊上，論文標題為「CRISPR/Cas9-mediated gene editing ameliorates neurotoxicity in mouse model of Huntington’s disease」。
論文通信作者、埃默裡大學醫學院人類遺傳學知名教授Xiao-Jiang Li博士說，儘管還需開展安全性和長期效果測試，但是這些發現為治療亨丁頓舞蹈症和其他的遺傳性神經退行性疾病打開新的途徑。
2.CRISPR-Cas9更容易發生脫靶突變吸人眼球，已導致一些CRISPR公司股票下降doi:10.1038/nmeth.4293上周，一項研究聲稱CRISPR-Cas9基因組編輯技術比預期中的更容易發生錯誤，這讓它成為了全世界的頭條新聞。也因此，一些投資者出售他們持有的基於CRISPR的生物技術公司的股票，這導致一些公司的股票價格下降高達15%。
在這項於2017年5月30日在線發表在Nature Methods期刊上的研究中，對脫靶效應的分析源自美國哥倫比亞大學的Stephen Tsang及其同事們在2016年開展的一項研究：他們利用CRISPR-Cas9技術成功地修復小鼠胚胎中一種導致失明的基因突變。在該項研究完成後，論文共同作者、美國史丹福大學眼科醫師VinitMahajan發現有機會研究酶Cas9如何容易發生錯誤。
Mahajan和他的同事們對來自他們的2016年那項研究中儲存的組織樣品的基因組進行測序，並且將它們與已發表的小鼠序列數據進行比較。在這些組織樣品序列中存在的但在公共序列資料庫中不存在的突變被鑑定為CRISPR介入導致的脫靶突變。
Mahajan團隊對這些結果感到吃驚：兩隻接受CRISPR處理的小鼠發生的突變比預期中的多10倍。更令人擔憂的是，在這些突變中，沒有一種突變存在於利用計算機算法預測到的Cas9脫靶位點之內。
Mahajan告訴《科學家》雜誌，「這些全基因組序列似乎在未被預測的區域中發生突變。這提示著利用體外培養的細胞開展的實驗可能並不能較好地預測當被注射到整個有機體內時，CRISPR蛋白是如何作出表現的。」
Mahajan提醒道，「這是一項非常小型的針對性研究：探究了小鼠中的單個基因。我們需要開展更多的研究來理解脫靶效應如何發揮作用，以及它如何在不同的情形下出現。」
澳大利亞國立大學遺傳學家GaétanBurgio說，他對這一發現並不感到吃驚。他說，「不同尋常之處在於這種脫靶效應的幅度」，不過他指出這種結果存在其他的解釋。Burgio告訴《科學家》雜誌，「很多脫靶突變不可能是由CRISPR導致的。」
Burgio繼續說道，這項研究存在的一個重大的缺陷是採用已發表的序列數據，而沒有設置對照小鼠，即放置在相同的實驗室條件下但未接受Cas9蛋白注射的動物。「在你的研究機構中使用的小鼠與那些已被測序過的小鼠存在基因漂移。」Burgio說，由於這一點，這項研究不能夠「梳理出哪些變異體是由於自然的基因變異導致的，哪些變異體是與CRISPR相關的。」
為了支持這種看法，批評者注意到這兩隻小鼠都具有很多相同的純合突變，這意味著相同的變異體存在於染色體的兩個拷貝上。這提示著它們可能是從一個相同的祖先遺傳下來的，而且在進行CRISPR處理之前就已存在於這些小鼠體內。Burgio說，「就我的個人經驗而言」，利用CRISPR-Cas9在兩隻不同的小鼠中「產生兩種完全一樣的點突變是非常罕見的」。
批評者也聲稱這篇論文存在著明顯的錯誤，比如不正確地鑑定脫靶位點，這可能影響著這些結果的可靠性。Mahajan並沒有提供詳細的反駁意見，但是將這些批評意見描述為是「非常錯誤的」。
不過，這項小型的初步研究足以吸人眼球，嚇壞投資者，比如幾家使用CRISPR基因編輯系統的生物技術公司看到它們的股票價格下降高達15%。Baral說，這種反應是較為罕見的，「但是當你的研究領域非常引人關注時，發生這種情形絕對不是沒有聽說過的。」
3.CRISPR裝備噬菌體讓「超級細菌」自殺！圖片摘自www.pixabay.com
眾所周知，CRISPR系統本來是細菌抵抗外界病毒侵染的免疫手段，但也許未來的某一天，CRISPR技術能夠幫助人們殺傷細菌本身。通過改造噬菌體使其攜帶CRISPR操作元件，科學家們希望這一工具能夠對耐藥性細菌進行有效殺傷，並且能夠用於改造機體的微生物組。
利用噬菌體殺傷細菌已經不是新鮮的概念了，相關的臨床治療最早可追溯至1920年。這一方法之所以十分令人感興趣，原因在於其特異性遠高於抗生素：僅僅對特異性的靶標細菌進行殺傷。此外，病毒還能夠刺透黏狀的細菌外膜，從而提高其殺傷水平。
目前，許多研究機構以及生物公司都在不斷挑戰CRISPR技術的界限，包括設計特異性識別抗生素耐藥性基因的CRISPR序列， 從而對耐藥性細菌進行有效殺傷。
4.「基因魔剪」專利之爭：中國專利沒授予張鋒，給了他的對手「基因魔剪」CRISPR/Cas9 技術的專利之爭又有了新進展。儘管今年年初在美國本土失利，但後續，歐洲專利局和英國專利局稱，美國加州大學伯克利分校將獲得有廣泛使用範疇的 CRISPR/Cas9 技術專利。如今，加州大學伯克利分校又將贏得來自中國的一分。
美國時間和瑞士時間當地 6 月 19 日，Intellia Therapeutics 和 CRISPR Therapeutics 兩家公司相繼發布消息稱，其已經獲得中國國家知識產權局授予的在 CRISPR 基因編輯技術上的專利。
5.Nat Chem Biol：突破！科學家成功優化CRISPR-Cpf1技術使其更加高效地編輯人類基因組圖片來自iStock/Vchal。
近日，一項刊登在國際雜誌Nature Chemical Biology上的研究報告中，來自斯克裡普斯研究所的研究人員通過研究改善了當前最先進的基因編輯技術，使其能夠更加精準地靶向切割並且粘貼人類和動物細胞中的基因，同時研究者還擴展了CRISPR-Cpf1基因編輯系統使其能夠用來研究以及幫助抵禦人類疾病。
文章中，研究人員通過將導向RNAs和「復用」能力合併，改善了CRISPR-Cpf1基因編輯系統的作用效率；研究者Guocai Zhong說道，這種系統能夠簡單、明顯改善同時對多個基因或單個基因多個位點的編輯能力，這或許對於靶向作用多個疾病相關的基因或疾病相關基因的多個位點非常有幫助。
研究者Farzan指出，效率是非常重要的，如果你能夠修飾肝臟中的25個細胞，似乎是無意義的，但如果能夠對肝臟中一半的細胞進行修飾，那麼這或許具有重大意義。當然如果該系統還能夠幫助修復肌肉細胞中基因的話，或許就能夠幫助恢復患者的肌肉功能。目前Cas9和Cpf1是最常用的兩種分子剪刀，研究者Farzan重點對Cpf1進行關注，因為其能夠更加精確地對哺乳動物細胞進行作用，Cpf1分子來自兩種類型的細菌：拉克諾螺旋菌科細菌和嗜酸菌屬細菌，這些分子的關鍵特性就是能夠對RNAs進行引導，但目前研究人員並不清楚這些分子如何同哺乳動物細胞所產生的RNA發生作用，文章中，研究者通過將螢火蟲發光基因編輯到細胞的染色體中進行深入研究，隨後他們發現，這種修飾後的CRISPR-Cpf1系統能夠像預期一樣發揮作用。
6.Sci Rep：高胰島素血症細胞模型和雄激素促進胰腺β細胞分化研究獲進展6月9日，NPG系列期刊《科學報告》（Scientific Reports）在線發表了中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院李尹雄課題組郭東升等的最新研究成果Modeling Congenital Hyperinsulinism with ABCC8-Deficient Human Embryonic Stem Cells Generated by CRISPR/Cas9，該研究建立了KATP通道失活型先天性高胰島素血症幹細胞模型並通過胰島β細胞分化在體外模擬了先天性高胰島素血症的相關臨床症狀。
該研究利用CRISPR/Cas9技術，在胚胎幹細胞株H1的基礎上，建立ABCC8基因失活突變細胞株。與野生型細胞株相比，ABCC8突變細胞株定向誘導分化的胰島β樣細胞具有更高的胰島素和C-肽分泌效率，較好地在體外複製出先天性高胰島素症的臨床表現，文章進一步分析ABCC8突變胰島β樣細胞對各種不同促進或移植胰島素分泌藥物的反應，為體外高通量藥物篩選模型提供了基礎。
7.Cell Res：一步到位 CRISPR徹底敲除動物體內特定基因圖片來自Bryan Satalino。
近期，自然出版集團旗下的《Cell Research》期刊上在線刊登了一篇來自中國科學院神經科學研究所楊輝博士團隊的最新論文。利用CRISPR基因編輯技術，研究人員能夠通過簡單的「一步反應」，徹底敲除小鼠或是猴子體內的特定基因。這一工具對於基礎科研中動物模型的建立能起到提速的作用，意義重大。
在本項研究中，來自中國的科學家們做了一個新的設想——如果在受精卵內注射多條sgRNA，是否會提高基因敲除的效率呢？為了檢驗這個想法，他們讓野生型的母鼠與帶有純合Actin-EGFP的公鼠進行交配，並在受精卵中注射入了Cas9 mRNA以及多條靶向GFP的sgRNA。這些sgRNA在GFP基因的外顯子中相隔10-200個鹼基對，研究人員們相信這樣的設計能以更高的頻率敲除特定基因。通過一系列實驗，他們證實通過引入多條sgRNA，就可以極大提高在動物體內的CRISPR基因編輯效率，做到對特定基因的完全敲除。
接下來，研究人員又測試了這套系統在猴子裡的效率。在猴子實驗中，他們在29個胚胎中各自注射了3條靶向Prrt2基因的sgRNA，這個基因的突變會導致陣發性運動誘發的運動障礙（paroxysmal kinesigenic dyskinesia， PKD）。這些胚胎被移植入了9隻代孕的母猴，並成功讓其中一隻母猴生下了兩隻小猴。其中一隻小猴的組織樣本表明，Prrt2基因得到了完全的敲除。這個結果也表明了這套系統在猴子體內的可行性。
接下來，研究人員分析了這套系統的脫靶效應。這篇論文提到，利用全基因組測序的手段，他們對活體動物進行了CRISPR潛在脫靶效應的評估。在小鼠的10201個潛在脫靶位點，以及猴子的19447個潛在脫靶位點中，他們發現的插入/刪除突變（indels）並不多見。其中有6隻小鼠和1隻猴子的體內未檢測出插入/刪除突變。這也在一定程度上，支持了CRISPR技術的安全性。
8.Cell Res：上海生科院等設計出高效精確基因靶向整合的新策略5 月 19 日，《細胞研究》期刊在線發表了題為《運用 CRISPR/Cas9 技術實現以同源臂介導的末端接合為基礎的靶向整合》的研究論文，該研究由中國科學院上海生命科學研究院神經科學研究所、腦科學與智能技術卓越創新中心楊輝研究組、基因編輯平臺施霖宇團隊與蘇州非人靈長類研究平臺孫強團隊合作完成。該研究設計了一種以同源臂介導的末端接合（Homology-Mediated End Joining， HMEJ）為基礎的基因敲入策略，它在很多種系統（體外培養的細胞、動物胚胎和體內組織）中比現有的基因敲入策略的效率都要高。基於更高效的編輯效率和更好的精確度，HMEJ 介導的基因敲入方法為一系列應用，包括基因編輯動物模型的建立、疾病的靶向基因治療等提供了非常大的應用前景。
在臨床治療應用方面，精確的靶向基因組編輯是非常重要的。規律成簇的間隔短回文重複（CRISPR）/CRISPR 相關蛋白 - 9 核酸酶（Cas9）系統通過在基因組上靶向形成 DNA 雙鏈斷裂（DSB）的方式極大地促進了轉基因的靶向整合。一旦產生一個 DSB，靶向整合可以通過多種策略來實現，包括同源重組（HR）、微同源臂介導的末端接合（MMEJ）或者非同源末端接合（NHEJ）。在本工作中，研究團隊基於 CRISPR/Cas9 系統，設計了一種新的以 HMEJ 為基礎的靶向精確整合策略，即利用帶有單個嚮導 RNA（sgRNA）靶向位點和長同源臂（約 800bp）的供體載體來實現高效的精確整合。
為了驗證這一想法，研究團隊構建了四種類型的供體載體來比較敲入效率：HMEJ 供體（sgRNA 靶向位置序列加在 800bp 長度的同源臂兩端）、HR 供體（只有 800bp 長度的同源臂）、NHEJ 供體（只有 sgRNA 靶向位置序列）以及 MMEJ 供體（sgRNA 靶向位置序列加在 20bp 的微同源臂兩端）。然後將這四種系統分別在體外培養的細胞系、小鼠和猴胚胎以及成體組織上進行效率比較。
研究者發現在體外培養的小鼠 ES 細胞和 N2a 細胞中，HMEJ 為基礎的定向整合效率與 HR 方法相比較並無顯著提高。然而，在原代星形膠質細胞和神經元細胞中，HMEJ 方法具有很高的 DNA 敲入效率。更重要的是，在小鼠和猴子胚胎中展現了非常強大的基因敲入能力。此外，通過尾靜脈水動力注射法感染成體小鼠的肝細胞，發現 HMEJ 介導的基因敲入效率遠高於以 HR、NHEJ 和 MMEJ 為基礎的策略。採用 AAV 定點注射感染小鼠的視皮層區（V1），結果顯示 HMEJ 介導的在成體非分裂的成熟神經元中靶向整合效率可以達到 50% 左右。最後，研究者對 HMEJ 介導的基因靶向整合的機制進行了探討。
9.Sci Rep：突破！利用CRISPR-Cas9技術開發出帕金森疾病新型篩選工具近日，一項發表在國際雜誌Scientific Reports上的研究報告中，來自中佛羅裡達大學（University of Central Florida）的研究人員通過研究利用突破性的基因編輯技術開發出了一種帕金森疾病的新型篩查工具，帕金森疾病是一種嚴重的神經系統疾病，這種技術能夠幫助科學家們在實驗室中對名為α-突觸核蛋白的大腦蛋白進行實時監測，這種蛋白和帕金森疾病發病直接相關。
文章中，研究人員利用CRISPR-Cas9基因編輯技術進行研究，這種系統是科學家們近年來使用最為廣泛的生物醫學工具，其能夠幫助科學家對植物和動物機體中的DNA進行精準化修飾，同時還不會殺滅正常細胞，如今這種新型的基因編輯系統慢慢地開始被研究人員用來開發治療癌症和帕金森等疾病的新型療法了。
CRISPR-Cas9基因編輯技術能夠對活體細胞中的DNA進行改變，同時其在不殺滅細胞的情況下還能夠實時對基因表達進行監測，如果沒有這種新型基因編輯技術，我們可能會從細胞中提取出所有的蛋白質來對其測定，這無疑會對細胞產生殺滅作用。這項研究中，研究者Burnett及其同事利用CRISPR技術對α-突觸核蛋白基因進行了編輯，並且在該基因中插入了一種螢光標記，每當細胞開始產生α-突觸核蛋白時，螢光標記就會發光；而這種反應就能夠被研究者們輕鬆觀察到，研究者Adams說道，發光越多就意味著α-突觸核蛋白的水平增加越明顯，這時候我們就要考慮是否個體已經處於疾病狀態了。他們發現，對光進行測定時一種測定α-突觸核蛋白產量的可靠方法；如果利用特殊藥物來處理任何一個被修飾的細胞，如果細胞不再產生螢光，那就意味著這種藥物或許能夠用來治療疾病。對細胞進行工程化修飾後，研究者就能夠對新型和當前已經存在的藥物進行篩選來觀察期如何調節患者機體中α-突觸核蛋白的水平。
10.Sci Rep：科學家有望利用CRISPR-Cas9成功治療多種遺傳性疾病日前，一項發表在國際雜誌Scientific Reports上的研究報告中，來自皇后大學的研究人員通過研究利用基因編輯工具成功治療了遺傳性疾病，相關研究或為後期研究人員開發新型療法治療罕見肝臟疾病及由遺傳突變誘發的其它疾病提供思路和希望。
文章中，研究者利用攜帶誘導基因缺失的細胞模型進行研究，最後開發出了能夠模擬人類疾病的缺陷性精氨酸酶-1，利用CRISPR基因編輯系統，研究人員就能夠將修復性的外顯子重新插入到細胞的遺傳結構中並且恢復酶類的功能。當然目前在細胞模型研究和全面的患者治療之間還存在著許多障礙，研究者Sin解釋道，一種新型的療法或許明顯優於當前方法給研究者帶來很多幫助，當前治療疾病的療法受限於藥理學製劑，比如氮清除藥物以及限制蛋白質的飲食等，利用CRISPR基因編輯技術治療精氨酸酶-1缺陷症或許就能夠為研究者提供治療其它相似遺傳性疾病的新型療法。
11.PNAS：上海生科院揭示DNA甲基化對番茄果實成熟的重要作用doi:10.1073/pnas.1705233114
5 月 15 日，《美國科學院院刊》（PNAS）在線發表了中國科學院上海生命科學研究院植物逆境生物學研究中心朱健康研究組和郎曌博研究組題為 Critical roles of DNA demethylation in the activation of ripening-induced genes and inhibition of ripening-repressed genes in tomato fruit 的研究論文。該研究利用 CRISPR/Cas 9 技術獲得了番茄 sldml2 的突變體植株，發現了番茄 SlDML2 調節的 DNA 去甲基化不僅可以激活成熟需要的基因，同時還可以抑制成熟不需要的基因，在調節番茄果實成熟的過程中發揮了重要作用。
在這項研究中，研究人員利用 CRISPR/Cas 9 技術獲得了番茄 sldml2 的突變體，SLDML2 基因與擬南芥中的 DNA 去甲基化酶基因 ROS1 具有很高的同源性。由於該基因的失活，使得全基因組範圍內的甲基化水平升高，誘導果實成熟的基因表達受到抑制，導致番茄果實不能正常成熟。進一步研究表明，SlDML2 參與了成熟相關基因的激活表達，主要參與了色素合成和口味形成、乙烯生物合成及信號傳導途徑、細胞壁水解等途徑中。另外，令研究者意外的是，SlDML2 介導的 DNA 去甲基化也抑制了果實成熟中並不需要的基因的表達，這些基因大多是參與光合作用及細胞壁合成的基因。這項研究不僅發現了 SIDML2 基因的 DNA 去甲基化功能，而且揭示了 DNA 去甲基化在果實成熟發育過程中的重要作用，極有可能調控著果實成熟發育的精確度。該發現揭示 DNA 甲基化可能是轉錄因子和植物激素之外的第三個最重要的調節果實成熟因子，具有重要的理論和應用價值。（生物谷 Bioon.com）
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