2017年4月30日/生物谷BIOON/---基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜誌列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短回文重複序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。
即將過去的4月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發現呢？小編梳理了一下這個月生物谷報導的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閱讀。
1.Nat Biotechnol：利用CRISPR表觀基因組編輯鑑定人基因組中的功能性調節元件doi:10.1038/nbt.3853
圖片來自Bryan Satalino。
大多數DNA並不編碼蛋白。了解這種基因組「暗物質」如何和何時在基因調節的何處發揮作用是一個巨大的任務。如今，科學家們開發出的一種工具可能提供幫助。在一篇於2017年4月3日在線發表在Nature Biotechnology期刊上的論文中，來自美國杜克大學的研究人員描述了一種高通量篩選技術：利用CRISPR-Cas9表觀基因組編輯鑑定人細胞基因組中的調節元件。這篇論文的標題為「CRISPR–Cas9 epigenome editing enables high-throughput screening for functional regulatory elements in the human genome」。論文通信作者為來自杜克大學的Gregory E Crawford、Timothy E Reddy和Charles A Gersbach。
研究結果證實導致更常見的複雜疾病（如心血管疾病、糖尿病和神經系統疾病）的大多數基因變異實際上發生於基因之間的調節區域。令人興奮的事情是有方法對非編碼基因組的功能進行標註。
Gersbach和同事們構建出靶向兩個感興趣的基因位點β-globin和HER2周圍的幾百萬個鹼基中的潛在調節元件的嚮導RNA（gRNA）文庫。他們隨後產生整合著螢光蛋白的細胞系，其中這種螢光蛋白指示靶基因激活。
這些研究人員將核酸酶活性已被滅活的兩種Cas9蛋白版本（被稱作dCas9）--- dCas9抑制版本（dCas9
KRAB）和dCas9激活版本（dCas9
p300）---中的一種導入到他們產生的細胞系中。dCas9
KRAB招募讓組蛋白H3K9發生甲基化的蛋白，從而導致異染色質形成和靶序列上的基因抑制。dCas9
p300結合到靶DNA增強子或啟動子上，促進組蛋白H3K27發生乙醯化，從而導致基因激活。
接下來，這些研究人員將較低水平的gRNA文庫導入到他們產生的細胞系中以便確保單個gRNA存在於每個細胞中。他們隨後基於螢光分選這些細胞，並且對存在於發生特別高水平和低水平靶基因表達的細胞中的gRNA進行測序。
序列鑑定印證了已知的調節元件，並且揭示出其他的DNA序列的新作用。很多這些序列（儘管不是所有序列）出現在dCas9
KRAB篩選和dCas9
p300篩選中。一些序列似乎對一種細胞類型中的基因發揮著調節作用，但是對另一種細胞類型中的相同基因並不會起著調節作用。儘管這些觀察到的基因表達變化是微妙的，但是這些研究人員證實了單個DNA序列的調節作用。
2.Nature：「武林高手」細菌CRISPR系統VS病毒，以快為尊doi:10.1038/nature21719
CRISPR是一種細菌免疫系統。它也是一種強大的基因組編輯工具。在與病毒的鬥爭當中，打響的第一槍通常是注射。想要感染細菌的病毒刺入細菌細胞的保護性細胞壁，注入它自己的遺傳密碼。如今，來自美國洛克菲勒大學的一項新的研究揭示出細菌如何利用CRISPR快速地抵抗這種到來的威脅。這一發現解答了一個由來已久的CRISPR如何發揮作用的難題。相關研究結果於2017年3月29日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「CRISPR–Cas systems exploit viral DNA injection to establish and maintain adaptive immunity」。
科學家們已經了解的基礎事實是：當細菌細胞被病毒DNA入侵時，它的CRISPR系統捕獲病毒的DNA片段（即間隔序列），並對這些DNA片段進行登記。一旦相同的病毒再次入侵，這種CRISPR系統就快速地識別它。
論文通信作者、洛克菲勒大學細菌學實驗室主任Luciano A. Marraffini說，「大約10年來，我們已知道CRISPR系統通過獲取病毒DNA片段發揮作用，但是在CRISPR免疫系統中這種關鍵的步驟在感染期間何時發生仍然是個謎。」他研究當地細菌中的CRISPR系統。
為了闡明這種時間安排，Marraffini和他的團隊設計實驗：在不同的時間點上阻止病毒生命周期。博士後研究員Joshua W. Modell和研究生Wenyan Jiang隨後研究了CRISPR系統以便觀察它何時和如何獲得來自病毒的間隔序列（spacer）。
並不是任何病毒DNA都對CRISPR有用。之前的研究已證實，它偏好來自DNA鬆散末端的間隔序列。這種偏好縮小了它的選擇，這是因為病毒DNA僅在感染的某些時間點採取線性形式，而在它的感染的剩餘時間，它的DNA兩個末端連接在一起，形成一種環形結構。
Marraffini團隊在三個時間點上阻止這種病毒感染。但是不論他們在何時阻斷這種感染，CRISPR持續地獲得間隔序列，這表明它從一開始，也就是在病毒注射它的基因組到細菌細胞中的時候，就獲得它們。
這種時間安排比較重要。通過從病毒首先注入細菌細胞中的DNA末端獲得間隔序列，CRISPR確保一旦這種感染下次再次出現，它就攻擊這種病毒。當Marraffini團隊改變CRISPR系統使得它含有與病毒最後注入細菌細胞中的DNA末端相匹配的間隔序列時，病毒仍然能夠增殖。
3.Cell：重磅！揭示抗CRISPR蛋白阻斷CRISPR系統機制doi:10.1016/j.cell.2017.03.012
想像一下細菌和病毒一直處於軍備競賽之中。對很多細菌而言，一種抵抗病毒感染的防禦線是一種複雜的RNA引導的「免疫系統」，即CRISPR-Cas。這個免疫系統的核心是一種識別病毒DNA和觸發它破壞的監視複合物。然而，病毒能夠反擊，利用抗CRISPR蛋白讓這種監視複合物不能夠發揮功能。但是，在此之前，沒有人準確地知道這些抗CRISPR蛋白如何發揮作用。
如今，來自美國國家過敏症與傳染病研究所、斯克裡普斯研究所、蒙大拿州立大學、加州大學舊金山分校和加拿大多倫多大學的研究人員首次解析出病毒抗CRISPR蛋白附著到一種細菌CRISPR監視複合物上時的結構。他們發現抗CRISPR蛋白的作用機制是封鎖CRISPR識別和攻擊病毒基因組的能力。一種抗CRISPR蛋白甚至「模擬」DNA，讓這種crRNA（CRISPR經轉錄產生的RNA）引導的檢測機器脫軌。相關研究結果發表在2017年3月23日的Cell期刊上，論文標題為「Structure Reveals Mechanisms of Viral Suppressors that Intercept a CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex」。論文通信作者為來自斯克裡普斯研究所的Gabriel C. Lander和來自蒙大拿州立大學的Blake Wiedenheft。
利用一種被稱作冷凍電鏡的高解析度成像技術，這些研究人員發現了CRISPR系統和抗CRISPR蛋白的三個重要的方面。
首先，他們準確地觀察這種CRISPR監視複合物如何識別病毒遺傳物質以便發現它應當在何處發起攻擊。這種監視複合物中的蛋白像握手那樣纏繞在細菌crRNA的周圍，讓這種crRNA的特定片段暴露出來。這種特定片段掃描病毒DNA，尋找它們能夠識別的基因序列。再者，這些研究人員分析了病毒抗CRISPR蛋白如何癱瘓這種監視複合物。他們發現一種抗CRISPR蛋白覆蓋住crRNA的這個暴露片段，從而阻止這種CRISPR系統掃描病毒DNA。
另一種抗CRISPR蛋白採用一種不同的策略。基於這種抗CRISPR蛋白的結合位置和負電荷，這些研究人員認為它起著模擬DNA的作用，誘導CRISPR結合這種抗CRISPR蛋白，而不是入侵的病毒DNA。
這些研究人員認為這種對抗CRISPR蛋白的新認識可能最終導致人們開發出更加複雜的和更加高效的基因編輯工具。抗CRISPR蛋白可能能夠被用於CRISPR系統之中來迅速阻斷基因編輯，或者科學家們可能能夠降解抗CRISPR蛋白來觸發基因編輯。
4.Nat Commun：利用CRISPR/Cas9發現新的衣原體藥物靶標doi:10.1038/ncomms15013
在一項新的研究中，來自英國劍橋大學韋爾科姆基金會桑格研究所和加拿大英屬哥倫比亞大學的研究人員開出一種創新性的技術來研究衣原體如何與人免疫系統相互作用。這些研究人員組合使用基因編輯技術和幹細胞技術來構建這種研究模型。他們鑑定出我們的免疫系統中的兩個基因IRF5和IL-10RA在抵抗衣原體感染中發揮著關鍵性的作用。這些結果為治療由衣原體導致的這種性傳播疾病鑑定出新的藥物靶標。相關研究結果於2017年4月25日在線發表在Nature Communications期刊上，論文標題為「Exploiting induced pluripotent stem cell-derived macrophages to unravel host factors influencing Chlamydia trachomatis pathogenesis」。
在這項研究中，這些研究人員利用人誘導性多能幹細胞（iPS細胞）製造出被稱作巨噬細胞的白細胞來研究衣原體感染。巨噬細胞在殺死衣原體限制它的感染中發揮著至關重要的作用。利用人iPS細胞產生的巨噬細胞以類似於從人血液之中獲得的巨噬細胞的方式對這種感染作出反應，這意味著它們比根據之前的方法產生的那些細胞更加類似於人體內的巨噬細胞。這種新的模型將能夠讓科學家們研究衣原體如何與人免疫系統相互作用從而避免抗生素耐藥性產生和疾病擴散。
這些研究人員利用CRISPR/Cas9對人iPS細胞進行基因編輯，然後觀察這種基因操縱對它們產生的巨噬細胞抵抗衣原體感染能力的影響。他們特別地發現了兩個巨噬細胞基因IRF5和IL-10RA在限制衣原體感染中發揮著關鍵作用。當這兩個基因被關閉時，這些巨噬細胞更容易遭受衣原體感染。這些結果提示著這兩個基因可能成為抵抗衣原體感染的新的藥物靶標。
doi:10.1038/cr.2017.57
圖片來自National Center for Microscopy and Imaging Research, UC San Diego。
利用基因標記技術"CRISPR/CAS9"，來自加州聖地牙哥分校的研究者與來自中國的研究者們能夠將突變的杆狀光學受體修復，使其功能恢復正常，這一技術成功地使兩種不同類型的患有視網膜退行性疾病的小鼠的視力恢復了正常。相關結果發表在最近的《Cell Research》雜誌上。
視網膜退行性疾病（Retinitis pigmentosa：RP）是一類遺傳性的視覺損傷疾病，其中存在60多個基因的突變。這些突變基因影響了眼睛光受體（即眼睛中一類感受光線，並將其轉換為電信號傳送到大腦中的特殊細胞類型）。目前存在兩種光受體細胞，杆狀細胞主要負責夜間的光信號以及餘光信號，錐細胞負責中心的視覺信號以及顏色的分辨。人們的視網膜中含有1.2億的杆細胞以及6百萬的錐細胞。
在這項研究中，作者們利用CRISPR／CAS9系統抑制了一類關鍵基因Nrl以及下遊的轉錄因子Nr2e3的活性。這種方法能夠將杆狀細胞分化形成錐狀細胞。"錐狀細胞的遺傳突變引發RP的風險相對較低一些，我們的方案因此能夠降低RP的症狀的發生機率"。他們在兩種不同的小鼠模型中試驗了上述方法。結果表明，這一方法能夠有效地將杆狀細胞轉變為錐狀細胞，而且小鼠的視力了得到了明顯的改善。
6.CRISPR「挑戰」抗生素！或解決全球耐藥問題！近幾年來，抗生素濫用導致的全球健康問題日益凸顯，越來越多的科學家開始尋找新的方法以對付諸如艱難梭菌（Clostridium difficile）等致命細菌帶來的感染問題。在這其中最為引人注目的，可以說是基於CRISPR/Cas9基因編輯技術的「有害菌自毀CRISPR藥丸」。
美國威斯康星大學麥迪遜分校食品科學家Jan-Peter Van Pijkeren表示，科學家們希望將CRISPR/Cas9系統轉變超為一種精細微生物治療體系，以精確殺死那些潛在的致命細菌。Van Pijkeren等人希望能夠使用噬菌體向艱難梭菌發送一個錯誤信息，使細菌對自己的DNA進行致死切割。
為了做到這一點，Van Pijkeren實驗室正在開發能夠攜帶特定CRISPR信息的噬菌體。為了讓病毒進入病人體內，Pijkeren團隊計劃將其感染至無毒細菌或益生菌混合物中，以藥丸或液體的形式為病人所直接攝入。當益生菌通過人體腸道被胃酸分解時，噬菌體就能夠爆發並感染任何附近的艱難梭菌，注入特定的CRISPR序列促進艱難梭菌自毀。
在Van Pijkeren的研究之前，使用噬菌體觸發CRISPR有效殺死皮膚細菌，幫助打擊發展中國家常見的腹瀉與感染志賀氏菌疾病已經被學術界所證實。
目前，包括法國Eligo Bioscience和美國Locus Biosciences等公司都開始在商業上推行基於CRISPR/Cas9的抗菌藥物。
7.Nat Commun：科學家成功利用CRISPR-Cas9技術追蹤活細胞內基因的表達doi:10.1038/ncomms14725
近日，刊登在國際雜誌Nature Communications上的一篇研究報告中，來自維吉尼亞大學醫學院的研究人員通過研究開發出了一種能夠追蹤活細胞中基因表達的新方法，研究者表示，他們能夠讓這些基因變紅，並且觀察其在三維空間中的運動方式，這樣就能夠像天空的星空圖一樣記錄基因的位置；類似於月亮會影響潮汐一樣，基因的位置也會影響其所帶來的效應，基因位置的3D圖譜或許就能夠幫助科學家們深入理解基因的作用機理及其影響人類健康的分子機制。
研究者Mazhar Adli表示，一直以來我都有一個夢想，就是實時對活細胞中任何基因組區域進行成像，利用金標準式的傳統方法研究者或許永遠無法獲取到相關數據，因為我們不得不殺滅所要成像的細胞；然而本文中研究者所開發的方法就可以對活細胞進行實時觀測。一般情況下DNA會聚集到細胞核中，我們都知道DNA並不是線性的，其會形成一些環狀結構（大型的三維環狀結構），研究者想從根本上對這些DNA的相互作用進行成像，並且闡明基因組是如何被組裝形成三維結構的。
這項研究中，研究者利用CRISPR基因編輯系統進行研究，首先他們利用螢光蛋白對特殊的基因組區域進行了標記，隨後利用CRISPR對染色體進行成像，隨後研究者就能夠根據自己的意願來開啟或關閉基因的表達，同時還能夠利用成像工具來觀察所染色體中基因所發生的變化。
這種新方法克服了長期以來基因成像技術的限制，研究者Adli說道，我們被告知永遠無法進行這種操作，目前有一些方法能夠讓我們在三維空間中對染色體進行研究，但如果要對成百上千萬個細胞進行研究的話就必須殺死這些細胞；而本文研究中我們在單一細胞水平下進行了相關研究，同時細胞仍然能夠保持活性，這樣我們就能夠以看電影的形式來觀看細胞中所發生的的變化。
8.Science：基於CRISPR/Cas13a的診斷平臺可檢測任何RNA分子，靈敏度增加一百萬倍doi:10.1126/science.aam9321
圖片來自Susanna M. Hamilton/Broad Communications。
在一項新的研究中，來自美國哈佛大學-麻省理工學院布羅德研究所（以下簡稱布羅德研究所）、麻省理工學院麥戈文腦研究所、麻省理工學院醫學工程與科學研究所、哈佛大學懷斯生物啟發工程研究所（Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering）的研究人員將一種靶向RNA（而不是DNA）的CRISPR相關酶（即Cas13a）改造為一種快速的、廉價的和高度靈敏的診斷工具，從而有潛力引發研究和全球公共衛生變革。相關研究結果於2017年4月13日在線發表在Science期刊上，論文標題為「Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2」。
在這項研究中，布羅德研究所成員Feng Zhang、Jim Collins、Deb Hung、Aviv Regev和Pardis Sabeti描述了這種靶向RNA的CRISPR相關酶如何被用作一種高度靈敏的檢測器---能夠指示最少至一個靶RNA或DNA分子的存在。論文第一作者Omar Abudayyeh和Jonathan Gootenberg將這種新的工具稱為「SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing）」；這種技術可能有朝一日被用來應對病毒性和細菌性流行病爆發、監控抗生素耐藥性和檢測癌症。
在2016年6月，Zhang和他的同事們首次描述了這種靶向RNA的CRISPR相關酶（之前被稱作C2c2，如今被稱作Cas13a），而且能夠經編程後切割細菌細胞中的特定RNA序列（Science, Published online:02 Jun 2016, doi:10.1126/science.aaf5573）。不同於靶向DNA的CRISPR相關酶（如Cas9和Cpf1），Cas13a能夠在切割它的靶RNA之後保持活性，而且可能表現出不加區別的切割活性，而且在一系列被稱作「附帶切割（collateral cleavage）」的作用當中，繼續切割其他的非靶RNA。在其發表的論文和申請的專利中，該團隊描述了這個CRISPR系統的廣泛生物技術應用，包括將它的RNA切割和附帶切割活性用於基礎研究、診斷和治療。
在這項新的研究中，這種SHERLOCK方法的靈敏度增加了一百萬倍。這種增加是由於Zhang團隊和布羅德研究所成員Jim Collins合作開展研究取得的結果。Collins之前一直在研究寨卡病毒的診斷方法（Cell, 19 May 2016, doi:10.1016/j.cell.2016.04.059）。在2014年，Collins和他在懷斯生物啟發工程研究所的團隊開發出一種快速的基於合成紙的伊波拉病毒測試方法，該方法所使用的試劑能夠在室溫下運輸和儲存。他們隨後對這種測試系統進行修改來檢測寨卡病毒，並且證實他們能夠通過加入低水平熱量來提高RNA在樣品中的濃度來提高這種系統的檢測靈敏度。 通過一起合作，Zhang團隊和Collins團隊能夠採用一種不同的依賴體溫的擴增過程來提高他們的測試樣品中的DNA或RNA水平。一旦這種水平增加，他們利用第二個擴增步驟將DNA轉化為RNA，從而使得他們將這種靶向RNA 的CRISPR工具的靈敏度增加了一百萬倍，而且這種工具能夠在幾乎任何環境下使用。
另外，這種CRISPR工具還包括一種RNA報告分子。當該報告分子被切割時，它會發出螢光。當Cas13a檢測到靶RNA序列時，它的無區分的RNA酶活性（即附帶切割活性）也會切割這種RNA報告分子，從而釋放可檢測到的螢光信號。
9.俄美科學家發現新型 CRISPR-Cas 系統來自俄羅斯斯科爾科沃科技學院和美國國立衛生研究所及麻省理工學院的聯合科研團隊發現了具有適應性細菌防禦功能的新型 CRISPR-Cas 系統，此類系統可用於研發基因編輯及基因組檢測新方法。該成果刊登在《Nature Reviews Microbiology》科學期刊上。
斯科爾科沃科技學院課題組進行了基因組資料庫中 CRISPR-Cas 系統特殊成分大規模篩查工作，由此發現了此類新型系統，課題組所發現的系統非同一般，與此前的研究相比類型完全不同。由於篩查了幾乎所有的原核生物基因組數據，可以認為，原核生物 CRISPR-Cas 系統的主要類型都已經被發現。
科研團隊進行了大量的生物信息分析工作，識別出之前未知的新型 CRISPR-Cas 系統，並進行了深入的理論和試驗定性研究。研究確定，VI- B 型系統中的補充蛋白具有系統運行調節作用；而 V - U 型系統則採用更小分子量的蛋白進行免疫防禦，該特點使其在基因工程領域具有廣泛的應用前景，因為小分子蛋白更易於操作。目前俄美聯合課題組正詳細研究該系統類型的特點，探索研發新型抗生素。
10.Sci Adv：重磅！研究人員使用CRISPR-Cpf1治療杜氏肌營養不良doi:10.1126/sciadv.1602814
德州大學西南醫學研究中心研究員利用新的基因編輯酶CRISPR-Cpf1在實驗室了人類細胞和老鼠體內的杜氏肌營養不良。該研究組過去使用原有的基因編輯系統CRISPR-Cas9糾正患有此病的老鼠模型和人類細胞內的杜氏肌缺陷。在目前的研究中，他們使用一種新的基因編輯系統，用於修復老鼠模型和人類細胞中的缺陷。
「我們研究了最常見的導致杜氏肌營養不良的患者細胞。我們在體外對它們進行糾正，以恢復細胞內缺失的抗肌營養不良蛋白。這項研究提供給了我們CRISPR工具箱中一個很有潛力的工具，」 Wellstone肌肉萎縮聯合研究中心、Hamon再生科學和醫學中心主任、分子生物學主席Eric Olson博士說。該研究發表於Science Advances雜誌。
CRISPR-Cpf1在很多關鍵方面不同於CRISPR-Cas9。Cpf1比Cas9酶小很多，這就使之更容易包裝到病毒內，因此也更加容易進入肌細胞。與Cas9 相比，它也能識別不同的DNA序列。就其實用性而言，它提供了更大的靈活性。「有一些基因很難用Cas9編輯，但是更容易用Cpf1修飾。因為這兩種蛋白質有不同的生化性質，能識別不同的DNA序列，所以這些特性能為基因編輯創造更多的選擇，」先天性心臟缺陷研究傑出教授Olson博士說。
「通過敲除突變區域或精確修復突變基因，CRISPR-Cpf1介導的基因編輯不僅糾正了杜氏肌萎縮症突變，而且還改善了肌肉收縮能力和強度，」分子生物學教授、Hamon再生科學和醫學研究中心副主任、Rhonda Bassel的合著者Duby博士說。
11.Nat Biotechnol：首次在人全基因組水平上證實基於CRISPR的單鹼基校正是準確的doi:10.1038/nbt.3852
圖片來自Institute for Basic Science。
在一項新的研究中，來自韓國基礎科學研究所（Institute for Basic Science, IBS）基因組工程中心的研究人員證實了一種近期開發的基因編輯方法的準確性。這種基因編輯工具起著「DNA剪刀」的作用，旨在鑑定和替換人基因組（大小為30億個鹼基對）中的僅一個核苷酸（或者說鹼基）。這是首次在全基因組水平上驗證了這種「鹼基編輯器（base editor）」的準確性。這種驗證將有助擴大這種方法在農業、牲畜和基因療法中的應用。相關研究結果於2017年4月10日在線發表在Nature Biotechnology期刊上，論文標題為「Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases」。論文通信作者為來自IBS基因組工程中心的Seuk-Min Ryu和Jin-Soo Kim。
基因編輯工具取得的快速進展已在生物界引起了很大轟動。一種主要的第三代DNA編輯技術是CRISPR。通過切除一小段DNA序列，CRISPR-Cas9和CRISPR-Cpf1被用來沉默或降低有缺陷的基因的表達。然而，去年，生物學家們已發現一種新的鹼基編輯器並不導致隨機的DNA刪除和插入，而是僅替換一個DNA鹼基。不同於現存技術的是，在這種鹼基編輯器中，CRISPR-Cas9的一種變體（nCas9, 切口酶）與胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase）APOBEC1融合在一起。APOBEC1將DNA中的鹼基C替換為鹼基T。這種DNA剪刀被嚮導RNA（gRNA）引導到DNA的正確位點上。然而，在此之前，人們並不知道這種鹼基編輯器是否僅在有缺陷的基因區域上發揮作用，或者它是否在脫靶位點上不必要地將鹼基C替換為鹼基T。
僅一個月之前，Kim團隊就在Nature Biotechnology期刊上報導首次成功地在小鼠體內進行單鹼基編輯（Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.3816，相關新聞參見「Nat Biotechnol：首次利用CRISPR培育出單核苷酸編輯轉基因小鼠」）。如今，該團隊在全基因組水平上證實了這種方法的準確性。
為了鑑定這種方法的可靠性，Kim團隊對一種被稱作Digenome-seq的錯誤校驗技術進行改進，以便讓它適用於這種鹼基編輯器方法。去年，當該團隊分析了CRISPR-Cpf1和CRISPR-Cas9的準確性時，他們就使用和驗證了Digenome-seq。他們也改進了電腦程式Digenome 2.0以便更加全面地鑑定脫靶位點，並且通過比較不同的gRNA發現降低脫靶編輯和增加特異性的gRNA。
12.Nat Chem Biol：利用CRISPR-Cas9激活細菌中沉默的基因簇，有望發現新的藥物doi:10.1038/nchembio.2341
為了抵抗疾病，很多醫藥庫中的武器是從細菌當中獲得的。如今，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術，研究人員揭示出沉默基因中隱藏著的更多潛在的寶藏。
作為一類常見的細菌，鏈黴菌被用來產生很多作為抗生素、抗癌試劑和其他藥物的化合物。在一項新的研究中，來自美國伊利諾伊大學和新加坡科技研究局的研究人員利用CRISPR-Cas9技術激活鏈黴菌中不表達的或者說沉默的基因簇。相關研究結果於2017年4月10日在線發表在Nature Chemical Biology期刊上，論文標題為「CRISPR–Cas9 strategy for activation of silent Streptomyces biosynthetic gene clusters」。論文通信作者為伊利諾伊大學厄巴納-香檳分校化學與與生化分子工程系教授Huimin Zhao。
為了挖掘未發現的基因組寶藏，這些研究人員首先利用計算工具鑑定出沉默的生物合成基因簇，即一小群參與製造化學產物的基因。他們隨後利用CRISPR/Cas9技術將一種強啟動子序列插入到他們想要激活的基因前面，促使細菌細胞製造這些基因簇編碼的天然產物。
這些研究人員成功地激活了一些沉默的生物合成基因簇。為了尋找候選藥物，每個天然產物需要加以分離和研究以便確定它發揮什麼功能。為此，從一種沉默的生物合成基因簇經激活產生的新的化合物當中，他們分離出一種化合物並且確定了它的結構。他們發現它具有與源自鏈黴菌的其他藥物完全不同的結構。
13.科學家利用基因編輯技術剔除小鼠愛滋病病毒doi:10.1016/j.ymthe.2017.03.012
美國天普大學華人科學家胡文輝等人近日報告說，他們利用基因編輯技術，有效剔除了一種人源化小鼠多個器官組織中的人類愛滋病病毒，朝著開展人類臨床試驗的方向邁出一大步。
在發表於美國《分子治療》雜誌的最新研究中，胡文輝和同校同事卡邁勒·哈利利以及匹茲堡大學楊文彬等人首先利用愛滋病病毒感染人源化BLT小鼠，然後藉助腺相關病毒（AAV）作為載體，把有「基因剪刀」之稱的CRISPR／Cas9基因編輯工具運送到潛伏感染小鼠體內。2到4周後，他們在多個小鼠器官組織中檢測到愛滋病病毒基因組被切除。
胡文輝副教授告訴新華社記者，愛滋病病毒基因易於突變，應用單靶點基因編輯有可能會出現病毒逃逸現象。為此，他們提出了多靶點基因編輯的新思路，針對愛滋病病毒轉錄區和結構區設計了4個嚮導RNA（核糖核酸），可引導Cas9酶到預定位置實現多靶點切除，顯著增加了愛滋病病毒的剔除效率。此外，這種病毒剔除方法不影響靶細胞的存活和功能，即「只殺病毒不殺細胞」。
胡文輝指出，目前，基因編輯療法尚不能100%清除動物體內的愛滋病病毒，但能夠顯著降低潛伏病毒量，因此與抗逆轉錄病毒藥物組合使用不失為一種有希望的愛滋病治療策略。
14.哈工大黃志偉課題組最新Nature！揭示魔剪CRISPR「抑制開關」分子機制doi:10.1038/nature22377
4 月 28 日，哈爾濱工業大學生命學院黃志偉教授課題組在《自然》（《Nature》）在線發表了題目為《Anti-CRISPR 蛋白抑制 CRISPR-SpyCas9 活性的分子機制》（Structural basis of CRISPR-SpyCas9 inhibition by an anti-CRISPR protein）的研究論文。
早先的研究發現一類來自於 Listeria monocytogenes 前噬菌體的 Anti-CRISPR 基因 AcrIIA4 等在細胞內能夠抑制 SpyCas9 的基因編輯活性，然而這些 Anti-CRISPR 基因抑制 SpyCas9 活性的分子機制並不清楚。
為了研究 AcrIIA2 或 AcrIIA4 是否能夠直接結合 SpyCas9，課題組首先建立體外生物化學研究系統，研究發現 Anti-CRISPR 蛋白 AcrIIA2 或 AcrIIA4 直接結合 SpyCas9-sgRNA 複合物，有趣的是 AcrIIA2 或 AcrIIA4 只和結合有 sgRNA 的 SpyCas9 有相互作用，而和單獨 SpyCas9 並沒有相互作用；進一步實驗發現 AcrIIA2 或 AcrIIA4 能夠直接抑制 SpyCas9 介導的目的 DNA 的剪切。
為了研究 AcrIIA4 直接抑制 SpyCas9 活性的分子機制，課題組純化出 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 複合物，並通過結構生物學研究方法解析了 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 複合物的晶體結構，該複合物結構揭示 AcrIIA4 蛋白構象是一個新的摺疊，它結合在 SpyCas9 的 CTD、TOPO 和 RuvC 三個結構域形成的凹槽區域。該凹槽區域正是 SpyCas9 上的底物 PAM DNA 的結合位點；另外來自 AcrIIA4 的β1 摺疊片前的 Loop 與 RuvC 活性位點接觸也加強了 AcrIIA4 對 SpyCas9 的抑制作用。上述結構觀察結果顯示 AcrIIA4 和底物 PAM DNA 競爭性結合 SpyCas9，AcrIIA4 比底物 PAM DNA 具有更強的親和力的實驗結果進一步支持了結構觀察的結果。接下來的生化實驗結果進一步證實 AcrIIA4 結合 SpyCas9 後抑制底物 PAM DNA 結合 SpyCas9，從而拮抗 SpyCas9 的活性。
非常顯著的是，AcrIIA4 的酸性胺基酸 Asp14、Asp37、Glu40、Asp69 和 Glu70 的位置完全與結合 SpyCas9 的底物 PAM DNA 的磷酸主鏈位置一致，而且上述 AcrIIA4 的胺基酸直接和 SpyCas9 PI 結構域上的 PAM DNA 識別胺基酸 Glu1108、Ser1109、Ser1216、Lys1200、Arg1335 和 Arg1333 互作。這些結構觀察結果揭示 AcrIIA4 通過模擬 PAM DNA 結合 SpyCas9。SpyCas9 蛋白的 AcrIIA4 結合胺基酸在同亞型 N. meningitidis Cas9 (NmeCas9) 中保守，而在不同亞型 II-C Listeria monocytogenes Cas9 (LmoCas9) 中並不保守，從而很好地解釋了 AcrIIA4 為什麼能抑制 LmoCas9 的活性，卻不能抑制 NmeCas9 的活性。
課題組通過進一步結構比較、分析發現，單獨 SpyCas9 上並不存在 AcrIIA4 的結合位點，SpyCas9-sgRNA 複合物的形成，使得 SpyCas9 構象發生顯著變化，組裝形成 AcrIIA4 結合位點，從而很好地解釋了本項目初始生化研究結果顯示的 AcrIIA4 只結合 SpyCas9-sgRNA 複合物，而不結合單獨 SpyCas9。該結果也和細菌細胞內單獨 SpyCas9 是瞬時存在的，而 SpyCas9-sgRNA 複合物是主要存在形式相一致。SpyCas9-sgRNA 複合物形成時，也是噬菌體被細菌 CRISPR 免疫系統「發現」並將被「幹擾」之時，因此，這個階段（SpyCas9-sgRNA 複合物期）是噬菌體抑制細菌的適應性免疫系統（CRISPR-Cas9）的最合適時期。
該研究揭示的 Anti-CRISPR 蛋白 AcrIIA4 抑制 SpyCas9 活性的分子機制，不僅對揭示細菌免疫系統（CRISPR-Cas9）與噬菌體防禦系統（Anti-CRISPR）「軍備競賽」的共進化分子機制具有重要的科學意義，而且為設計時間、空間特異性地，或條件性地精確控制 SpyCas9 基因編輯活性的工具提供了結構基礎。
15.Cell Res:中科院生化細胞所李勁松研究組等建立快速分析致死基因在不同組織中功能的新方法doi:10.1038/cr.2017.58
2017年4月21日，國際學術權威刊物自然出版集團旗下子刊《Cell Research》雜誌在線發表了中國科學院生物化學與細胞生物學研究所李勁松研究組和中國科學院神經科學研究所於翔研究組的最新研究成果：「CRISPR-Cas9-mediated genome editing in one blastomere of two-cell embryos reveals a novel Tet3 function in regulating neocortical development」，研究利用CRISPR/Cas9技術和細胞譜系示蹤技術對小鼠兩細胞胚胎中的單個卵裂球進行了基因敲除，一步法獲得了Tet3基因敲除的健康嵌合小鼠，並對Tet3基因敲除後大腦皮層和海馬神經元的突觸傳遞進行了探究。該方法是一種快速地分析致死基因在各個組織器官中功能的新方法。李勁松組博士生汪凌波和於翔組博士生李敏寅為本文的共同第一作者，李勁松研究員和於翔研究員為論文通訊作者。
DNA雙加氧酶Tet3是Tet蛋白家族的一個重要成員，之前的研究發現， Tet3全身性敲除小鼠有部分可以發育到出生，但是出生後24小時內死亡。因此，若想研究Tet3在成年小鼠中的功能，需要藉助Cre/loxP系統在不同的組織中進行特異性的敲除。這就帶來一系列的問題：待研究的組織是否有特異性的Cre小鼠資源；若想在不同組織中研究基因的功能，則需要不同的Cre小鼠；條件性敲除小鼠交配周期長。
基於此，李勁松團隊提出了一種基於嵌合體的快速分析致死基因潛在功能的方法。首先，他們在mT/mG小鼠胚胎的一細胞時期(受精卵時期)注射了Cas9 mRNA，而後在兩細胞時期，隨機地在兩細胞的其中一個卵裂球注射Cre mRNA和Tet3 sgRNAs。將這些注射過的胚胎移植到假孕小鼠體內，就可以獲得Tet3敲除的嵌合鼠，這些嵌合鼠可以正常成活，並且在各個組織器官中都有紅色/綠色兩種細胞存在，其中紅色細胞是野生型，綠色細胞是Tet3敲除的。為簡化基因型鑑定同時為保證敲除的成功率，研究人員進一步將多個sgNRAs(3-4個)注射到單個卵裂球中，這種策略得到的小鼠很容易通過PCR條帶鑑定出是否有大片段敲除，同時可以把一整個外顯子刪除掉保證了敲除的成功率。他們對這些嵌合體小鼠的大腦進行分析，發現Tet3敲除並不影響大腦皮層主要細胞類型的發育和分化。研究人員進一步通過對鄰近的野生型和Tet3敲除細胞進行成對電生理記錄，發現Tet3敲除之後，小鼠大腦皮層和海馬錐體神經元的興奮性與抑制性突觸傳遞均發生了顯著性的改變，表現為興奮性突觸傳遞的上調和抑制性突觸傳遞的下調。研究結果提示Tet3在大腦不同腦區神經環路的發育中起到了重要的作用。（生物谷 Bioon.com）
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