2019年4月30日訊/生物谷BIOON/---基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜誌列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短回文重複序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是
細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。
圖片來自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。
2018年11月26日，中國科學家賀建奎聲稱世界上首批經過基因編輯的嬰兒---一對雙胞胎女性嬰兒---在11月出生。他利用一種強大的基因編輯工具CRISPR-Cas9對這對雙胞胎的一個基因進行修改，使得她們出生後就能夠天然地抵抗HIV感染。這也是世界首例免疫愛滋病基因編輯嬰兒。這條消息瞬間在國內外網站上迅速發酵，引發千層浪。有部分科學家支持賀建奎的研究，但是更多的是質疑，甚至是譴責。
即將過去的3月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發現呢？小編梳理了一下這個月生物谷報導的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閱讀。
1.Nat Med：優化的CRISPR-Cas9基因編輯有望治療鐮狀細胞病在一項新的研究中，來自美國達納法伯癌症研究所、波士頓兒童醫院和麻薩諸塞大學醫學院等研究機構的研究人員通過將CRISPR-Cas9基因編輯應用於患者自己的造血幹細胞中，開發出一種治療一種最為常見的遺傳性血液疾病---鐮狀細胞病（sickle cell disease）---的策略。這種方法克服了之前的技術挑戰，而且要比過去更有效地對造血幹細胞進行編輯。相關研究結果於2019年3月25日在線發表在Nature Medicine期刊上，論文標題為「Highly efficient therapeutic gene editing of human hematopoietic stem cells」。論文通訊作者為Daniel Bauer博士，論文第一作者為Yuxuan Wu和Jing Zeng。
這項新的研究使用了CRISPR-Cas9技術，特別是麻薩諸塞大學醫學院的Scot Wolfe博士領導的一個研究團隊進行基因修飾過的Cas9蛋白，來優化基因編輯。在之前對人造血幹/祖細胞的基因組進行編輯的嘗試中，一旦將這些基因編輯的細胞植入骨髓中，基因編輯的效率、特異性和長期穩定性就會發生變化。這種新技術提高了基因編輯的靶向性和持久性。
之前在波士頓兒童醫院的研究已表明，讓一種名為BCL11A的基因失活允許紅細胞即便在出生後也會繼續產生胎兒形式的血紅蛋白。胎兒血紅蛋白不會產生鐮刀形狀，能夠代替有缺陷的「成年」血紅蛋白。最近，Bauer發現了一個更安全的靶標：BCL11A基因的增強子，僅在紅細胞中有活性。
Bauer說，「通過使用我們開發的這種新型的非常有效的方法，我們能夠在我們收集的幾乎所有的造血幹細胞中對BCL11A的增強子進行編輯，從而克服了對這些細胞進行基因編輯所面臨的一些技術挑戰。在我們的實驗中，95%以上的增強子序列拷貝以我們期望的治療方式發生改變。」
這種策略使得攜帶來自鐮狀細胞病患者的造血幹細胞的小鼠能夠產生具有足夠的胎兒血紅蛋白的紅細胞，從而阻止紅細胞產生鐮刀形狀。Bauer團隊發現這些經過基因編輯的造血幹細胞在移植到骨髓中後產生得到基因校正的紅細胞。隨後，當從這些小鼠中分離出造血幹細胞並移植到其他小鼠中時，這些造血幹細胞再次定植並且仍然攜帶治療性的基因變化。
2.bioRxiv：成功利用CRISPR-Cas9對爬行動物進行基因編輯在一項新的研究中，來自美國喬治亞大學的研究人員發現一種可在爬行動物身上使用CRISPR-Cas9基因編輯工具的方法。相關研究結果近期發表在bioRxiv預印版伺服器上，論文標題為「CRISPR-Cas9 Gene Editing in Lizards Through Microinjection of UnfertilizedOocytes」。在這篇論文中，他們描述了他們開發的這種技術，以及它在測試的蜥蜴中的效果。
隨著科學家們試圖更多地了解CRISPR-Cas9本身、它的工作機制及其潛在的應用，它已被用於各種各樣的實驗。不過，在早期，科學家們認為CRISPR不能與爬行動物一起使用，這是因為爬行動物具有獨特的生殖系統---比如，雌性蜥蜴儲存精子，僅在最方便的使用加以使用，這就使得注射CRISPR-Cas9工具較為困難（如果不是不可能的話）。此外，還存在將針插入卵殼而不損壞它和阻止胚胎發育的問題。但是，存在困難並未意味著不可能，正如這些研究人員發現的那樣，他們開發出一種成功的解決方法：利用CRISPR-Cas9對幾隻蜥蜴中的細胞進行基因編輯。
為了在蜥蜴中使用CRISPR-Cas9，這些研究人員切開了幾隻測試的雌性蜥蜴並在受精前將這種編輯工具直接注射到卵子中，同時這些卵子仍然存在於母體的卵巢中，然後順其自然發育。總之，他們將這種編輯工具注射到21隻蜥蜴的146個卵子中。在他們的實驗中，CRISPR-Cas9經編程後對酪氨酸酶編碼基因進行編輯，其中這個基因負責確定蜥蜴的顏色---當它受到失活時，蜥蜴將患上白化病（albino）。他們報導，這種編輯技術成功了四次---4隻患有白化病的蜥蜴出生了。他們指出他們的技術應當也適用於其他種類的蜥蜴。
3.Mol Cell:新型DNA剪切技術比傳統CRISPR-Cas9更優越近年來，一種名為CRISPR-Cas9的工具改變了基因研究，就像一把小剪刀一樣，允許科學家在精確的位置剪斷和編輯DNA鏈。但有時候，完成這項工作需要的不僅僅是剪刀。現在，一個合作的國際團隊推出了一種新的基於CRISPR的工具，它更像是一臺粉碎機，能夠清除人體細胞中的長鏈DNA。
（圖片來源：Zhang lab, University of Michigan）
在最近發表在《Molecular Cell》雜誌上的研究中，作者描述了他們如何成功地獲得了一種名為Type I CRISPR-Cas3的CRISPR-Cas系統，這是第一次在人類細胞中作為遠程DNA編輯工具，提供了比當前Cas9更有效的定位和刪除長鏈DNA的方法。這種工具可以用於基因研究，以了解疾病的基礎，並治療與長鏈DNA相關的疾病。
在該研究中，作者他嘗試將細菌CRISPR成分作為蛋白質傳遞到人類胚胎幹細胞和另一種稱為HAP1的細胞中。通過guideRNA分子，該團隊成功地刪除了從幾百鹼基對到100千鹼基的靶DNA的部分。
4.Science子刊：重大進展！改變Cas9和gRNA遞送比例可提高CRISPR編輯效率在一項新的研究中，來自美國德克薩斯大學西南醫學中心的研究人員開發出一種方法來提高杜興氏肌肉營養不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）CRISPR基因編輯的效率，這可能對優化針對其他疾病的基因療法產生影響。相關研究結果發表在2019年3月6日的Science Advances期刊上，論文標題為「CRISPR-Cas9 corrects Duchenne muscular dystrophy exon 44 deletion mutations in mice and human cells」。
這些研究人員利用一種單切割CRISPR基因編輯技術校正小鼠和人類細胞中的一種導致DMD的常見突變。DMD是一種由抗肌萎縮蛋白（dystrophin）缺失導致的致命疾病。在對這種技術進行測試時，他們發現調整CRISPR基因編輯組分的劑量能夠顯著地改善編輯後的基因產生的抗肌萎縮蛋白的數量。他們進一步發現，這些組分的最佳比例的變化取決於DNA的哪一部分被編輯。
論文通訊作者、德克薩斯大學西南醫學中心的Eric Olson博士說，「當我們在抗肌萎縮蛋白編碼基因的其他缺陷部分測試CRISPR時，調節我們的組分配方以獲得最佳結果可能很重要。這種新的見解可能進一步促進了CRISPR在治療DMD和許多其他疾病中的應用。」
5.bioRxiv：新研究揭示CRISPR系統的抗病毒工作機制十年前，「沒有人認為細菌具有複雜的適應性免疫系統，」蒙大拿州立大學文學與科學學院和農業學院微生物學和免疫學系副教授Blake Wiedenheft說。然而，從那以後，研究人員發現了一種細菌利用機器分子檢測和摧毀入侵病毒的機制。這種免疫反應被稱為CRISPR，這是一個縮寫，描述了細菌如何將病毒DNA片段整合到自己的基因組中，作為未來識別和對抗病毒的一種方式。
對於Wiedenheft而言，不斷增長的CRISPR知識引發了其他問題：病毒是否找到了破壞細菌防禦的方法，內在的分子機制如何？
Wiedenheft在3月11日發表於Molecular Cell期刊的一篇科學論文中發表了他的團隊最新發現，不僅描述了CRISPR防禦的新細節，而且還發現了擴大科學家對資源豐富病毒的理解的發現。
使用強大的電子顯微鏡和尖端的圖像處理技術，Wiedenheft和他的合作者，斯克裡普斯研究所的副教授Gabriel Lander，可以看到一個複雜的CRISPR分子通過展開類似於「燈塔」的分子臂來響應病毒DNA。Wiedenheft解釋說，燈塔就像「發出危險信號的紅色閃光燈」，作為其他CRISPR分子的生物化學線索來摧毀病毒。
6.Nature子刊：當心！DNA扭曲增加CRISPR-Cas9脫靶編輯風險在一項新的研究中，來自英國帝國理工學院和阿斯利康公司的研究人員指出當使用CRISPR-Cas9時，在基因表達和其他細胞過程中經常發生的DNA扭曲可能導致基因組脫靶變化。這些研究結果可能有助於為在臨床應用上提高基因編輯準確性鋪平道路。相關研究結果發表在2019年3月的Nature Structural and Molecular Biology期刊上，論文標題為「DNA stretching induces Cas9 off-target activity」。
圖片來自David Rueda。
CRISPR-Cas9是一種允許人們發現和編輯DNA鏈的基因編輯工具。隨著科學家們在醫學、藥物發現和農業等多個領域使用CRISPR-Cas9，它因它的多種用途獲得了全球的認可。在這項新的研究中，CRISPR-Cas9的準確度和精確度是通過一種新的方法進行研究的：使用光學鑷子---一種使用雷射束操縱DNA的工具---模擬DNA自然經歷的扭曲，就像是細胞的分子機器讀取了它。他們隨後利用CRISPR-Cas9編輯基因並使用螢光顯微鏡監測它的準確性。結果表明，當DNA鬆散和鬆弛時，CRISPR是準確的，但是當DNA發生扭曲---在這種情況下，DNA遭受高度拉伸---時，CRISPR編輯準確性降低，並且觀察到脫靶編輯。了解這種效應將有助於設計具有更高準確度的CRISPR系統，以及評估這種風險的方法。
論文共同通訊作者、帝國理工學院的David Rueda教授說，「CRISPR-Cas9作為一種有助於預防或抵抗因DNA突變引起的疾病的潛在工具而備受矚目，我們想要研究它的準確性。當我們操縱DNA結構來模擬DNA經歷的自然扭曲時，我們發現在非預期的位點上進行編輯。在這種情形下，CRISPR-Cas9在靶向系統中顯示多達50%的錯配，這將是在臨床環境中使用這種基因編輯工具時需要考慮的一個問題。」
7.New Phytologist：基於CRISPR技術可以標記多物種的基因組自2012年提出其機制以來，CRISPR / Cas9系統一直在科學界引起漣漪。許多科學家已經發現了Cas9蛋白的剪刀樣特性的不同應用。最近，來自萊布尼茨植物遺傳和作物植物研究所（IPK Gatersleben）的研究人員現在已經找到了一種以稍微不同的方式利用RNA /蛋白質複合物的方法。除了傳統的原位雜交外，新的RNA引導的核酸內切酶 - 原位標記工具（RGEN-ISL）不再需要DNA的變性。因此，新方法使染色質保持完整，從而可以研究樣品的結構。此外，RGEN-ISL可與蛋白質檢測方法結合使用，並可實現標記過程的實時可視化。雖然RGEN-ISL最初是為植物基因組開發的，但它可用於所有生物體，並且在染色體生物學領域顯示出一種很有前途的新工具。
在過去的30年中，螢光原位雜交（FISH）已成為用於在染色體水平上可視化原位DNA序列的已建立且常用的方法。然而，該方法需要使所研究的DNA變性，因此經常損害樣品的結構。通過將RGEN-ISL方法基於CRISPR-Cas9，IPK研究人員設法繞過FISH的變性步驟，同時整合了常規FISH方法的所需螢光標記特性。由於新的細胞遺傳學工具保留了樣本的結構，它開闢了研究基因組時空結構的選擇。
進一步的實驗表明，RGEN-ISL優於傳統方法組合，例如FISH和免疫組織化學，需要較少的製備並且相對更快和更便宜。此外，新方法可在4°C至37°C的寬溫度範圍內發揮作用，還可與其他蛋白質檢測和成像方法結合使用。進一步的優點是RGEN-ISL允許實時可視化CRISPR/ Cas9介導的DNA標記，因此揭示了反應的動力學。
8.Nat Biotechnol：新研究能夠降低基因編輯的出錯機率最近，韓國IBS基因組工程中心的研究人員已經確定了基於CRISPR靶向腺嘌呤的基因編輯工具（ABE）的錯誤率。對這一工具的錯誤率的評估對於其在臨床和生物技術中的應用至關重要。他們的研究結果發表在Nature Biotechnology上。
由Jin-Soo Kim領導的研究小組研究了人類細胞中最近開發的ABE蛋白ABE7.10的錯誤率。他們確定了受ABE7.10影響的人類基因組位置，並掃描了超出目標的錯誤。為此，他們使用了改編版的Digenome-seq技術。修改後的Digenome-seq可以檢測整個人類基因組中平均60個脫靶錯誤。有趣的是，儘管這三種蛋白質被設計成針對同一個位點，但它們識別出不同的脫靶點。
IBS生物學家還展示了一些策略來抑制脫靶修改的數量。在guide RNA末尾添加幾個G減少了脫靶錯誤，以及使用不同類型的Cas9。通過預裝配的核糖核蛋白，而不是通過質粒，等等。
9.Science：我國李亦學課題組和楊輝課題組揭示胞嘧啶鹼基編輯器誘導大量的單位點脫靶突變基因組編輯在治療由致命性突變引起的
遺傳疾病上有很大的潛力。對基因組編輯的脫靶效應進行全面分析是驗證這種編輯實用性所必需的。科學家們已開發出多種方法來檢測全基因組範圍內的基因編輯脫靶位點。然而，這些方法並不適用於檢測體內的單核苷酸變異（SNV）。
在一項新的研究中，中國科學院的李亦學（Yixue Li）課題組、楊輝（Hui Yang）課題組和美國史丹福大學的Lars M. Steinmetz課題組開發出一種稱為GOTI（genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection, 利用雙細胞胚胎注射進行全基因組脫靶分析）的方法來評估三種經常使用的基因編輯工具---CRISPR/Cas9、胞嘧啶鹼基編輯器3（BE3, rAPOBEC1-nCas9-UGI）、腺嘌呤鹼基編輯器7.10（ABE7.10, TadA-TadA*-nCas9）---誘導的脫靶效應。簡言之，這些研究人員將CRISPR/Cas9、BE3或ABE7.10與Cre mRNA一起注射到源自Ai9（CAG-LoxP-Stop-LoxP-tdTomato）小鼠的雙細胞胚胎的卵裂球中。在胚胎期第14.5天（ED14.5）時，基於tdTomato的表達，利用螢光活化細胞分選方法（FACS）對經過編輯的卵裂球和未經過編輯的卵裂球的後代細胞進行分選。與此同時，在ED14.5時，整個胚胎也很容易經消化後獲得足夠的單細胞。他們隨後對tdTomato陽性細胞和tdTomato陰性細胞單獨地進行全基因組測序（WGS）。以來自相同胚胎的tdTomato陰性樣本作為對照，利用三種算法對來自相同胚胎的tdTomato陽性樣本中的SNV和indel（insertion or deletion, 插入或刪除）進行研究。
在這項新的研究中，這些研究人員包括了12個組：一個Cre組（Cre-only, 僅注射Cre）、6個具有或不具有單向導RNA（sgRNA）的Cas9組（Cas9、Cas9-LacZ、Cas9-Pde6b、Cas9-Tyr-A、Cas9-Tyr-B和Cas9-Tyr-C）、三個具有或不具有sgRNA的BE3組（BE3、BE3-Tyr-C和BE3-Tyr-D）和兩個具有或不具有sgRNA的ABE組（ABE7.10和ABE7.10-Tyr-E）。首先，他們通過桑格測序（Sanger sequencing）在胚胎8細胞和ED14.5時驗證了他們的方法在胚胎中的在靶效率。為了進一步探究在靶效率和潛在的全基因組脫靶效應，他們對來自ED14.5胚胎的46個樣本進行全基因組測序，並證實Cas9、BE3和ABE7.10在tdTomato陽性細胞中高效地誘導indel和核苷酸替換。
令人吃驚的是，這些研究人員在經過BE3處理的胚胎中，發現了平均每個胚胎存在283個SNV，這一水平至少要比在經過Cre或Cas9處理的胚胎中觀察到的高出20倍。相反之下，在經過ABE7.10處理的胚胎中，平均每個胚胎存在10個SNV，這一頻率接近於自發性突變率。他們進一步地將在BE3-only組（即僅注射BE3的組）中鑑定出的脫靶位點與在BE3-Tyr-C組或BE3-Tyr-D組中鑑定出的脫靶位點進行了比較，並發現sgRNA的存在並不誘導顯著高的SNV（P=0.21，Kruskal-Wallis test）。此外，這些變異是在tdTomato陽性細胞而不是在tdTomato陰性細胞中特異地鑑定出的。
令人關注的是，在經過BE3編輯的細胞中鑑定出的90%以上的SNV是G>A或C>T，這一突變偏好並沒有在經過Cre、Cas9或ABE7.10處理的細胞中觀察到。這一突變偏好與APOBEC1本身的突變偏好相同，這表明這些突變並不是自發的而是由BE3編輯誘導的。之前的研究已表明APOBEC家族的幾個成員（包括APOBEC1）發揮作用需要單鏈DNA。與此相一致的是，這些研究人員的分析表明由BE3誘導的SNV在轉錄區域中顯著富集，特別是在高度表達的基因中。有趣的是，這些脫靶位點中的任何一個並不與經過BE3處理的胚胎中觀察到的相同，而且也不與預測的脫靶突變發生重疊。此外，也並未在脫靶序列和靶序列之間觀察到相似性，然而，預測的排名靠前的脫靶位點與BE3的在靶位點存在著較高的序列相似性。因此，BE3引起的脫靶SNV並不依賴於sgRNA並且可能是由APOBEC1過度表達導致的。
在經過BE3處理的胚胎中觀察到的1698個SNV中，26個SNV位於外顯子中，其中的14個導致非同義變化。這些研究人員成功地將通過PCR擴增了其中的20個SNV並通過桑格測序證實了它們的存在。他們還發現1個SNV位於一個原癌基因中，13個SNV位於
腫瘤抑制基因中，這就讓人對BE3編輯的致癌風險感到擔憂。這種風險可能通過表達較低數量的BE3加以降低。然而，他們發現當表達較低數量的BE3時，在靶效率逐漸降低。
令人關注的是，這些研究人員發現大量新生突變是由BE3誘導的，這一點在之前的研究中並未報導過。一種可能的解釋就是GOTI研究了源自單個經過基因編輯的卵裂球的細胞群體，而之前的研究使用了大量的細胞群體，在那裡，編輯是可變的，而且由於細胞群體平均化，這會導致隨機的脫靶信號丟失。不同於BE3的是，ABE7.10並不導致SNV數量增加，這很可能是缺乏TadA的DNA結合能力。這些鹼基編輯器的脫靶效應可能通過降低APOBEC1的DNA結合能力或者使用不同的胞苷脫氨酶版本來加以降低。總之，GOTI可用於研究多種基因編輯工具的脫靶效應，而且不受在不同個體中存在的單核苷酸多態性（SNP）的幹擾。
10.Science：中科院高彩霞課題組發現胞嘧啶鹼基編輯器引發意想不到的全基因組脫靶突變在一項新的研究中，中國科學院的高彩霞（Caixia Gao）課題組通過對作為一種重要的作物物種的水稻進行全基因組測序對胞嘧啶鹼基編輯器（BE3和HF1-BE3）和腺嘌呤鹼基編輯器（ABE）產生的脫靶突變進行全面調查。他們發現胞嘧啶鹼基編輯器（BE3和HF1-BE3）誘導全基因組脫靶突變。相關研究結果於2019年2月28日在線發表在Science期刊上，論文標題為「Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice」。
圖片來自Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences。
在這項新的研究中，高彩霞課題組選擇了三種廣泛使用的鹼基編輯器：BE3、高保真BE3（HF1-BE3）和ABE，其中BE3和HF1-BE3屬於胞嘧啶鹼基編輯器（CBE）。將靶向11個基因組位點的總共14個鹼基編輯器構造體通過農桿菌轉化方法轉化到水稻中。他們利用全基因組測序對由BE3、HF1-BE3或ABE編輯的再生T0水稻植物；經過這些鹼基編輯器轉化但沒有經過sgRNA轉化的水稻植物以及兩個對照組水稻植物（即野生型水稻和轉基因水稻的無效分離株）進行分析。
這些鹼基編輯器組（即BE3組、HF1-BE3組和ABE組）和對照組在發現的插入或刪除（insertion or deletion, indel）數量上沒有顯著差異。相反之下，BE3組和HF1-BE3組要比ABE組和對照組具有顯著更多的單核苷酸變異（SNV）。
在這些鹼基編輯器組和對照組中，每株水稻植物的C>T單核苷酸變異（SNV）的平均數量為：203（BE3）、347（HF1-BE3）、88（ABE）和105（對照組）。因此，BE3組和HF1-BE3組水稻植物中的C>T單核苷酸變異數量分別比對照組水稻植物高94.5％和231.9％。
總而言之，由高彩霞課題組產生的數據表明是BE3和HF1-BE3，而並不是ABE，在水稻中誘導全基因組脫靶突變。這些脫靶突變主要是C>T單核苷酸變異，在轉錄的基因區域中富集，通過當前的計算機方法是無法預測的。含有胞嘧啶脫氨酶的鹼基轉化單元可能是由BE3和HF1-BE3引發的較高數量的脫靶單核苷酸變異的原因，因而需要加以優化以提高胞嘧啶鹼基編輯器（BE3和HF1-BE3）的特異性。（生物谷 Bioon.com）