高親和力抗體的研發對於新冠病毒診斷和治療具有重要意義。目前的兩條主要研究策略，一是挖掘已開發的具有交叉保護活性的SARS病毒抗體，這種方法快速但與新冠病毒的親和力較低。另一種方式是從感染患者中分離單克隆抗體，但是難以大規模分離製備。近日，日本名古屋大學的研究者開發了轉錄翻譯偶聯嘌呤黴素接頭展示(TRAP)的新技術，在短時間內就可篩選出靶向新冠病毒刺突蛋白的單克隆抗體，並且對病毒中和效力顯著，為快速開發新發傳染病抗體提供了新的途徑，研究結果發表在國際知名期刊Science Advances上。
標題
體外篩選技術是一類重要的抗體類似蛋白生產技術，這種技術避開了繁瑣的動物免疫，而利用免疫蛋白支架如單鏈可變區、單域抗體、非免疫球蛋白，快速篩選抗體庫。經典的方法包括噬菌體展示技術、mRNA展示技術等，然而噬菌體肽庫太小，而mRNA肽庫構建又耗時過長。研究者在前期研究開發了一種高通量篩選體外功能肽段的方法，即TRAP技術：DNA模板加入體系後，在T7聚合酶催化下轉錄為mRNA，迅速結合嘌呤黴素-DNA接頭，由核糖體進行翻譯，嘌呤黴素再連接到多肽鏈上，逆轉錄、免疫沉澱後篩選功能多肽，再通過PCR擴增進行下一輪篩選。
TRAP體外篩選
研究者發現，單抗體的DNA 3'模板會不依賴啟動子轉錄形成雜交鏈阻礙後續反應，因此需要通過引入甲氧基修飾阻礙無效轉錄，實驗結果明顯提高了展示效率。同時研究者也注意到首輪篩選時存在抗體庫種類有限的問題，於是通過外源添加mRNA庫，提高了抗體多樣性。EGFR1、HER2的抗體篩選證實了該方法的有效性。
為了構建新冠病毒抗體庫，研究者首先在單抗體BC、FG環上引入隨機突變，並採用含多種密碼子的混合液進行隨機庫構建。同時預先構建了大規模的mRNA庫，在後續多輪篩選中可以擴充多樣性靶向多種位點。研究者針對SARS-CoV-2刺突蛋白S1亞基和受體結合結構域進行TRAP篩選，第一輪採用mRNA庫作為模板，後續逐步篩選高親和力抗體，經過6輪篩選在3-4天內就獲得了單抗株。研究者選取了其中豐度最高的9株抗體，進行生物活性的測定。酶聯免疫吸附實驗(ELISA)顯示不同抗體均可以與S1亞基RBD結構域結合，在37℃均保持穩定，部分抗體在50℃依然保持活性。生物膜層光幹涉實驗進一步測定了抗體結合動力學參數，7株抗體表現出亞納摩爾至納摩爾級別的親和力。
酶聯免疫吸附和親和力常數測定
研究者進一步利用免疫磁珠pull-down實驗分析了篩選出單抗體的特異性，其中四株抗體能夠特異性結合SARS-CoV-2 S1蛋白而不識別SARS-CoV S1蛋白，另外四株抗體能同時結合兩種病毒S1蛋白，而16號抗體則能夠形成多價抗體靶向刺突蛋白三聚體。利用ELISA實驗，研究者分析了不同抗體對新冠刺突蛋白-ACE2結合的抑制效果，發現其中特異性靶向新冠病毒S1亞基的四株抗體能夠以納摩爾水平阻礙病毒蛋白與受體結合。
抗體阻斷ACE2-S1結合
基於上述的發現，研究者設計了雙抗體夾心ELISA。9種抗體識別三類抗原表位，如1、11、12、18號識別位點不在ACE2結合區，而6、10號則識別S1-ACE2結合位點，因此可以分別作為檢測抗體和識別抗體，其中10-12號雙抗體的檢測靈敏度最高。儘管檢出限與實際樣本可能還有一定差距，但是與其他方法聯用有望用於快速檢測。
夾心ELISA檢測
研究者進一步分析了抗體對完整病毒顆粒的結合能力，免疫磁珠結合RT-PCR顯示了抗體有效結合併沉澱了病毒粒子。利用這種抗體免疫磁珠偶聯RT-qPCR的方法最低可以在1uL液體中檢出0-1個病毒粒子。為了說明該方法可以應用於臨床快速檢測，研究者又對COVID-19患者鼻拭子進行了「pull down」偶聯RT-qPCR的方法，檢出率明顯高於傳統qPCR，但是由於患者體內存在中和抗體，有一定程度幹擾。
pull down qPCR與傳統qPCR比較
為了進一步提高抗體的結合能力，研究者試圖將抗體形成並列二聚體的結構，選取其中三株構建二聚體，親和力明顯提高，達到亞皮摩爾級別。這主要是二聯抗體能夠通過橋聯作用與抗原形成網絡狀結構所致。
二聚體親和力
6號單克隆抗體及其二聚體具有最高的親和力，研究者推測該抗體可能有效阻斷病毒感染。在表達TMPRSS2的VeroE6細胞單抗體能夠有效抑制新冠病毒，IC50達到亞納摩爾。
單抗阻斷病毒感染
該研究開發了一種快速體外篩選抗體類似蛋白的方法，同時研究者又以此為基礎設計了SAR-CoV-2特異的夾心ELISA、pull-down RT-PCR等，同時構建了二聚體抗體用於阻斷病毒感染，有望推廣應用到臨床環境。這些都為應對新冠病毒等新發傳染病提供了重要的研究思路和技術路線。
文章來源：Science
本期編輯：Reynard Fox
審閱：Tony
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