RT-PCR引物的選擇

2020-12-05 生物谷

隨機引物             適用於長的或具有發卡結構的RNA。適用於rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反轉錄反應。主要用於單一模板的RT-PCR反應。                                                   Oligo dT              適用於具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由於Oligo dT要結合到PolyA 尾巴上，所以對RNA樣品的質量要求較高，即使有少量降解也 會使全長cDNA合成量大大減少。                                                   基因特異性引物   與模板序列互補的引物，適用於目的序列已知的情況。天為時 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特別適合於與基因特異性 引物連用。

PCR擴增後出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異

性擴增帶與非特異性擴增帶。

 

原因

建議

引物

引物特異性差

重新設計引物，改變引物的位置和長度，增強其特異性或使用巢式PCR

引物濃度過高

適當減少引物濃度

Mg2+濃度

Mg2+濃度過高

適當降低Mg2+濃度，從1mM到3mM，間隔0.5mM進行一系列反應，確定對於每個模板和引物對的最佳鎂離子濃度。

耐熱聚合酶

酶量過多

以0.5U為間隔適當減少酶量

退火溫度

退火溫度過低

適當提高退火溫度或採用二階段溫度法

PCR循環次數

PCR循環次數過多

減少PCR循環次數

 

4. 操作多份樣品時，製備反應混合液，先將dNTP、緩衝液、引物和酶混合好，然後分裝，這樣即可以減少操作，避免汙染，又可以增加反應的精確度；
5. 最後加入反應模板，加入後蓋緊反應管

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