半定量RT-PCR的引物可以用於定螢光定量Q-PCR嗎?

2021-01-08 中國教育裝備採購網

　　經驗結論

　　1、如果PCR產物很短，200bp以內，那麼用SYBR做Q-PCR沒有問題的話，可以用。

　　2、如果PCR產物比較長，那最好重新設計引物。

　　3、如果用TaqMan做Q-PCR，那很可能需要重新設計引物。這個一般產物都在100bp左右，太大了酶的外切效率太差。上海創賽科技提供0.5ml單管PCR管，平蓋，無DNA，RNA酶，商品編號：C81-PCR000500-1000隻/包，價格248元。

　　4、如果RT-PCR引物的效率不好，SYBR會降低一點PCR效率，那會導致PCR無法擴增。也只能重新設計引物。上海創賽科技提供163795-75-3，SYBR Green1，螢光染料，BR ，商品編號：D23-RS1151-100微升，價格416元。

　　原因

　　1. 產物越短，相對而言，PCR效率越高。

　　而qPCR如果要Relative Quantification的話，使用ddCT方法的假設是100%PCR的效率。因此產物越長越偏離這個假設。定量越不準確。特別是當跟內參做比較，而內參的擴增效率不同。這樣就產生兩條不同的回歸線。而這兩條線由於效率不同而相交。導致在交點上下的時候定量相對關係發生改變，引起明顯的定量誤差。這個還是要小心的。即使絕對定量，PCR效率越高，反應就越敏感，曲線的動態範圍更大。也就是說可以定量的範圍更廣。因此一般不超過200bp。當然也確實有人做比較大的產物，但是一般不會這麼推薦。

　　2. qPCR的目的是獲得螢光數據，而不是獲得PCR產物。

　　所以一般都以儘快完成PCR周期為目標。自然要儘量縮短每個周期的時間。如果產物太長自然要更多的延長時間。對qPCR來說實在沒有必要。

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