按照這個方程進行計算，一條長度為15nt的引物，在哺乳動物基因組(N約等於3X109)中的結合位點(指完全匹配)只有一個。對於一個16nt的引物來說，在複雜度為10'的哺乳動物cDNA文庫中恰好含有能與其完全匹配的序列的概率只有1/10。
然而，這個計算方法的前提是： 4種鹼基在哺乳動物基因組中是隨機分布的。這個前提其實不存在，因為哺乳動物具有密碼子偏愛性，另外，有相當部分的基因組序列是由重複序列或基因家族組成的。
為了降低非特異性結合，引物的長度要比.上述方法計算出的長度長一些。由於重複序列的存在，即使引物長度超過20nt，只有不超過85%的哺乳動物基因組序列可以精確地配對。
設計引物的時候，要用引物序列比對DNA資料庫，以確保引物只和靶基因配對，而不會和載體、其他基因及重複序列配對。表7-1提供了引物設計中的一些原則，如果認真執行這些標準，那麼在很大程度上可以避免失敗。
下列步驟用於篩選引物：
1.分析靶基因和引物結合位點，確保不存在多個同種核苷酸的聚集區，沒有明顯形成二級結構的可能，不會形成自互補，也不會和靶基因的其他部位結合(參見第9章中「實時螢光PCR反應引物、探針設計和反應條件優化」部分)
2.按照表7-1的標準，把可能的正向及反向引物列出來，按照下面列出的方程，計算其熔解溫度。
3.選擇匹配良好的正、反向引物，兩條引物的GC含量要相當。兩條引物及擴增產物的GC含量最好能夠相當，並且最好為40%~60%。