來源：上海申能博彩生物科技有限公司 2007-07-26 09:39
1.引物是如何合成的？
目前引物合成基本採用固相亞磷醯胺三酯法。DNA合成儀有很多種, 主要都是由ABI/PE 公司生產，無論採用什麼機器合成，合成的原理都相同，主要差別在於合成產率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環用時的多少。
亞磷醯胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。亞磷醯胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。
第一步是將預先連接在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5'-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5'-羥基；
第二步，合成DNA的原料，亞磷醯胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5'-羥基發生縮合反應。
第三步，帶帽(capping)反應，縮合反應中可能有極少數5'-羥基沒有參加反應(少於2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其後繼續發生反應，這種短片段可以在純化時分離掉。
第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷醯形式轉變為更穩定的磷酸三酯。
經過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5'-羥基上的保護基團DMT，重複以上步驟，直到所有要求合成的鹼基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。
通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPC, PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮,脫鹽，沉澱。沉澱後的引物用水懸浮，測定OD260定量，根據定單要求分裝。
2.引物純化方式有哪些，如何選擇？
◆ C18柱脫鹽：有人稱其為簡易反相柱，它對DNA有特異性的吸附，可以被有機溶解洗脫，但不會被水洗脫，所以能有效地去除鹽分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。實際上，它是一種脫鹽的作用。這種方法一般不會對普通PCR反應產生影響。對於需要用於測序、克隆的引物不能使用這個級別。
◆ OPC純化： OPC純化是根據DNA保護基（DMTr基）和Cartridge柱中樹脂間的親合力作用的原理進行純化目的DNA片段。OPC法純化的DNA純度大於95%。適用於40mer以下引物的純化。
◆ PAGE純：PAGE純化法是使用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，對DNA片段進行分離，然後從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化後的DNA純度大於95%，對長鏈Oligo DNA (大於50mer)的純化特別有效。
◆ HPLC純化：HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對DNA片段進行純化。純度可以大於99%。主要用於短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點是成本較高，批量生產效率不高。
3.引物的OD數如何定量？
答：引物合成引物OD數是這樣測定的：用紫外分光光度計，波長260nm，石英比色杯，光程為1釐米，測定溶液的光密度。測定時溶液的光密度最好稀釋到0.2-1.0之間。DNA乾粉用一定體積的水充分振蕩溶解以後，用1ml水稀釋測OD值。需要根據稀釋倍數換算出母液的OD值。
4.需要什麼級別的引物？
答：引物常用的純化方式C18脫鹽，OPC純化，PAGE純化，HPLC純化。根據實驗需要，確定訂購引物的純度級別。
應用 引物長度要求 純度級別要求
一般PCR擴增 < 45base OPC
>45 base PAGE
診斷PCR擴增 < 40base OPC, PAGE
DNA測序 20base左右 OPC
亞克隆，點突變等 根據實驗要求定 OPC, PAGE，HPLC
基因構建（全基因合成） 根據實驗要求定 PAGE
反義核酸 根據實驗要求定 PAGE
修飾引物 根據實驗要求定 PAGE, HPLC
5.最長可以合成多長的引物？
答：引物越長，出現問題的概率就越大。我們合成過120base的引物，但是產率很低。除非需要，建議合成片段長度不要超過80mer,按照目前的引物合成效率，
80mer的粗產品，全長（還不一定正確）引物的百分比不會超過40%，後續處理還有丟失很多，最後的產量是很低。
6.需要合成多少OD數？
答：根據實驗目的確定。一般PCR擴增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標準PCR反應。如果是做基因拼接或退火後做連接，1 OD就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要5-10 OD。做全基因構建的引物都比較長，但是我們有些研究人員也要求高OD數。片段越長, 最後全長得率就越低，出錯的機率就越大。超出需要之外的OD數要求，其實也是對社會資源的一種浪費，同時也從一個側面反映了部分研究人員，特別是新手的自信心不足，總覺得需要重複多次才能成功。
7.如何檢測引物的純度？
答：實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯醯胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素乾粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間後(約2-3小時)，剝膠，用螢光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB 染色或銀染方式染色。
8.如何計算引物的濃度？
答：引物保存在高濃度的狀況下比較穩定。引物一般配製成10-50pmol/ul。 溶解前您需要核對合成報告單和引物標籤上的引物OD數是否一致。如果不一致，請和我們聯繫。我們可以根據生產記錄查到實際產量是多少。
一般情況下，我們建議將引物的濃度配製成50pmol/ul，加水的體積（微升）按下列方式計算：V (微升)= OD數*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以從合成報告單上獲得。如果需要配製成其他濃度，按上述公式換算。
注意：1 OD260= 33 ug/ml.
9.如何計算引物的Tm值？
答：引物設計軟體都可以給出Tm，引物長度，鹼基組成，引物使用緩衝的離子強度有關。
長度為25mer以下的引物，Tm計算公式為：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
對於更長的寡聚核苷酸，Tm計算公式為：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中，Size = 引物長度。
Tm的定義：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.
10.引物（含修飾）的分子量是如何確定的？
答：非修飾的引物的Molecular Weight在隨引物提供的報告單上都有明確的標示。如果需要估計一個引物的分子量按每個鹼基的平均分子量為324.5，引物的分子量=鹼基數 x 鹼基的平均分子量。或按下列公式計算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（Nx * Wx）+( Ni* Wi) +16* Ns– 62.
NA, NG, NC, NT, Ni分別為引物中鹼基A或G或C或T或I的數量，WA, WC, WG, W, Wi分別為引物中鹼基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分別為修飾基團的數目和分子量。
對於混合鹼基的分子量為混合鹼基的分子量總合除以混合數，例如G+A混合的分子量為（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns為硫代數目，硫代每個位置增加分子量16。
常規鹼基分子量
Base Molecular Weight
A 313.21
C 289.18
G 329.21
T 304.19
I 314.2
U 290.17
常規修飾基團分子量
5』-Biotin 405.45 3』-TAMARA 623.60
5』-(6 FAM) 537.46 3』-Dabsyl 498.49
5』-HEX 744.13 3』-(6 FAM) 569.46
5』-TET 675.24 3』-Amino Modifier C3 153.07
5』-Cy5 533.63 3』-Amino Modifier C7 209.18
5』-Cy3 507.59 3』-Thiol Modifier C3 154.12
11.如何溶解引物？
答：乾燥後的引物質地非常疏鬆，開蓋前最好離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據計算出的體積加入去離子無菌水或10mM Tris pH7.5緩衝液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩定。
12.如何保存引物？
答：引物合成後，經過一系列處理和純化步驟，旋轉乾燥而成片狀物質。引物在溶解前，室溫狀態下可以長期保存。溶解後的引物-20度可以長期保存。如果對實驗的重複性要求較高，合成的OD數較大，建議分裝，避免反覆凍融。修飾螢光引物需要避光保存。
13.合成的引物5』端是否有磷酸化
答：合成的引物5』為羥基，沒有磷酸基團。如果需要您可以用多核苷酸激酶進行5'端磷酸化，或者要求我們合成時直接在5'或3'端進行磷酸化，需要另外收費。
14.引物片段退火後不能連接到載體上是什麼問題？
連接反應需要引物的5』磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對稱結構，退火的難度較大，退火時需要提高退火溫度。
15.測序發現引物有突變是怎麼回事？
答：測序發現引物區域有突變，特別是40個鹼基以下的引物, 發生的概率不大，但是肯定也會發生。用戶一般可以放心，引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列COPY到合成儀的，鹼基輸錯的機會不多。我們有一套控制辦法，預防鹼基輸入錯誤。發生這種突變的原因有很多解釋，人們還沒有辦法徹底解決這個問題。引物合成的固相合成原理都一樣，採用的機器也基本相同，合成主要原料都是由可數的幾家跨國公司提供的，所有每個合成服務商遇到的問題也基本類似，沒有人可以超脫。
引物合成是一種多步驟的化學反應，合成效率最高也就是99%，副產品不可以避免。引物序列中插入突變往往是鹼基重複，一般認為，偶連過程中，正在偶連的部分單體發生丟失DMT,導致單體又接了上去，故發生插入同一鹼基的突變。至於缺失突變，一般認為是一般認為是帶帽(capping)反應不徹底造成的，Caping反應主要是封閉極少數5'-羥基沒有參加反應單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時將不能繼續參與合成。對於鹼基置換的突變，產生的原因一般認為是鹼基不能100%脫保護，即引物上可能含有殘留保護基團，引物的這些區域不能很好地與互補鏈配對，當擴增的產品被亞克隆轉化到大腸桿菌中，可能被細菌中修復系統補上了非配對的鹼基。置換突變通常發生在G 轉換成其它鹼基。鹼基G在一定條件下可以轉化為烯醇異構體 （脫嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA複製和擴增過程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作鹼基A，測序就會發現鹼基G-A置換。脫嘌呤現象在富含嘌呤的引物中發生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物後處理脫保護階段如果被降解，測序就會發現鹼基G或A的缺失。
引物合成過程中，造成鹼基插入，缺失，置換突變的因素客觀存在，有不少降低發生的頻率建議和措施，但是這些措施還停留在實驗室階段，還沒有能夠應用到規模化生產中。
16.長鏈引物為什麼出錯的機率非常高？
答：引物合成時，每一步反應效率都不能達到100%，產生鹼基插入，缺失，置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴增，不可能絕對保證擴增產物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴增過程所產生的頻率都要高。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。
17.如果測序發現突變，該如何處理？
答：對您遇到的困惑，我們表示同情。遇到這種情況，首先和我們取得聯繫，我們的生產人員會檢查生產的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，我們在電腦中保留所有原始數據。如果確認引物合成序列沒有輸錯，我們建議重新挑取克隆測序，您可能會找到正確克隆的。根據我們經驗，40個鹼基以下的引物，測1-2個克隆就可以了；40個以上的特別是用於全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個克隆突變的位點都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。您也可以要求我們將引物免費重合一次，不過重合的引物和第一次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的機率。基因拼接過程中，如果發現一段區域突變點不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。
18.引物是經過PAGE純化的，為什麼還有鹼基缺失或插入？
答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區分引物之間一個鹼基的差別。但是製備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，解析度已下降，電泳後割帶回收目的引物時，很難說不割到差別僅幾個鹼基的引物。國內有一個不好的現象，PAGE純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，導致割的條帶有時可能比較寬。建議：您如果減少OD數，引物遇到的問題可能就會少一些。
19. TaqMan 探針設計的基本原則是什麼？
答：下列原則供您參考。
◆TaqMan 探針位置儘可能靠近擴增引物（擴增產物50-150bp），但不能與引物重疊。
◆長度一般為18-40mer 。
◆G-C含量控制在40-80%左右。
◆避免連續相同鹼基的出現，特別是要避免GGGG或更多G出現。
◆在引物的5』端避免使用G。
◆選用比較多的鹼基C。
◆退火溫度Tm控制在 68-70C左右。
有用的螢光染料參數
Name Name 吸收波長 發射波長 colors
6-FAM 6-carboxy-fluorescein 494nm 518nm Green
TET 5-tetrachloro-fluorescein 521nm 538nm Orange
HEX 5-hexachloro-fluorescein 535nm 553nm Pink
TAMRA tetramethyl-6-carboxyrhodamine 560nm 582nm Rose
ROX 6-carboxy-x-rhodamine 587nm 607nm Red
Cy3 Indodicarbocyanine 552nm 570nm Red
Cy5 Indodicarbocyanine 643nm 667nm Violet
20.Primer設計的基本原則是什麼？
答：引物設計的下列原則供您參考。
◆引物長度一般在18-35mer。
◆G-C含量控制在40-60%左右。
◆避免近3』端有酶切位點或髮夾結構。
◆如果可能避免在3』端最後5個鹼基有2個以上的G或C。
◆如果可能避免在3』端最後1個鹼基為A。
◆避免連續相同鹼基的出現，特別是要避免GGGG或更多G出現。
◆退火溫度Tm控制在 58-60C左右。
◆如果是設計點突變引物，突變點應儘可能在引物的中間。
21.為什麼引物的OD260/OD280小於1.5 ？
答：我們多次接到類似的投訴：引物應該全是DNA,但是OD260/OD280的比值為什麼那麼低，怎麼會有蛋白質汙染？遇到這樣的投訴有時我們感到很是為難。投訴者有時心情很不好，還不聽解釋。撇開其他不談，引物化學合成，哪裡有機會汙染到蛋白質？
需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由於引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個20mer 同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值與引物的鹼基組成密切相關。
A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions
Base Composition A260/280
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.50
5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.85
5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.15
5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 1.14
5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.66
22.同樣的OD用PAGE檢測，EB染色為什麼深淺不一？
答：通常可以用EB染色的方法來判斷雙鏈DNA的量(如質粒DNA)，因為EB可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA，由於鹼基組成不同，形成二級結構的可能性不同，EB的染色程度也會有差異，比如Oligo(dT)等不形成二級結構，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來定量，而用紫外分光光度計檢測。同樣道理，用EB染色來照片不適合所有引物。
23.引物不純會有什麼後果？
答：引物不純可能會導致：1)非特異性擴增；2)無法用預先設計在引物5'端酶切位點的酶切開，特別是沒有保護鹼基的引物；3) 用於測序出現雙峰或亂峰。解決辦法重新合成或重新純化。
24.為什麼我們的引物重合了幾遍都擴增不出來？
答：有些PCR擴增沒有成功，懷疑是引物不好。PCR擴增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在實驗時設置對照來判定原因。
如果您懷疑引物的問題，請您首先測定您溶解的引物的OD值，看實驗時加入的引物量是否正確。如果量是正常的，請您告訴我司您的引物編號，我們會複查留存樣品。如不明原因，我們免費為您重新合成一次。如果仍然不能擴增，請您查找其它原因。
25.已經溶解的引物，為什麼原先使用正常，而過一段時間再使用就不好了？
答：如果您溶解引物的水PH過低或汙染了菌或核酸酶，會使引物降解。使用時沒有充分解凍混合，液體不均勻也可能會造成引物加入量不準確。建議分裝引物，避免反覆凍溶。建議使用10mM Tris pH7.5緩衝液溶解引物，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）, 引物在這種條件下不穩定。還有一種可能性是引物沒有問題，而是PCR使用材料特別是模板的質量與先前使用的不完全一致。
26.引物質量好壞的判斷標準是什麼？
答：合成的引物和您的定單序列一致，而不是能否擴增出您所需要的產物。
27.PCR擴增不出就引物有問題嗎？
答：基本不是。當今發展出各色各樣的PCR擴增技術，各色各樣的高溫聚合酶，就是來解決PCR擴增中遇到的擴不出，擴增效率低的問題。如槽式PCR就是擴增那些拷貝數很低的基因片段。 有些重複片段的擴增, GC含量高的片段，非要採用特殊擴增手段才能擴增出了。
引物擴增不出，主要是下列兩種情況比較常見（1） RT-PCR。請注意，很多基因通過常規RT –PCR方法是很難不增出來的。 RT- PCR成功的關鍵在於RT的反應的RNA質量和目標基因在特定組織和細胞中含量。（2）從基因組中擴增。一般情況下，基因在基因組中都是單拷貝，基因組作為模板需要嚴格控制用量。基因組DNA過高，會影響反應體系中的Mg和pH。
28.PCR擴增有很強的非特異條帶，說明引物有汙染嗎？
答：不能。瞧，擴增目標很弱或沒有，道是非特異性條帶很亮，說明引物不純或有汙染。一些用戶如是說。我們曾分析過一些非特異條帶，測序發現在這些非特異性片段的兩頭至少可以發現一條引物序列。我們只能說非特異性擴增一般是模板汙染（如RNA中汙染基因組）或擴增條件不合適所致。
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