自動DNA合成儀合成的引物無需進一步純化即可用於標準PCR反應

2021-01-14 新課時代

使用Taq聚合酶擴增的效率大約是0.70,據此計算，當產物積累到1.4X 1012~7X1012個分子後，酶量就不足以支持PCR循環的進行了(參見信息欄「Taq DNA聚合酶」)。

●引物。影響擴增反應的效率和擴增特異性的因素很多，最為關鍵的是寡核苷酸引物的設計。仔細地設計引物，可獲得所需片段的高產量擴增，抑制可能的、非特異性的、不必要的序列擴增，便於擴增產物的後續操作。

雖然引物的效率在很大程度上影響到PCR反應的成敗，但是，它們的設計準則更多的是基於常識，而不是眾所周知的熱力學和結構學原理。遵從這些經驗性原則不能保證成功，但是，無視它們，很可能導致失敗。

更多的信息參見表7-1。在某些情況下，需要同時擴增多個片段，這時應使用一種叫做多重PCR的擴增反應。反應體系中包含有不止一對引物，更多的信息請參見本章中的多重PCR部分。

標準反應中可含有無限量的引物，通常每種引物為0.1 ~0.5umo/L(6X 1012~3X1013個分子)。這個量足夠1kb的DNA片段擴增至少30個循環，更高濃度的引物會錯配，從而導致非特異擴增。

自動DNA合成儀合成的引物無需進一步純化即可用於標準PCR反應，如果引物經過市售樹脂柱色譜(如NENSORB; NEN Life Science公司產品)或變性聚丙烯醯胺凝膠純化，單拷貝的哺乳動物基因組模板的擴增效率會更高(參見第2章，方案10)。

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