來源：來源網絡 2007-07-26 09:41
1.如何測定引物的OD值？
用紫外分光光度計在260nm波長測定溶液的吸光度來定量，請注意紫外分光光度計的使用，測定時溶液的吸光度最好稀釋到0.2-0.8之間(吸光度太高或太低會有較大的誤差)。DNA乾粉用一定體積的水充分振蕩溶解以後，取部分溶液稀釋到1ml並在1ml標準比色皿中測定其吸光度，即為所測體積的OD值，進而可以計算出母液的OD值。
舉例：您拿到一管幹粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取該母液50μL稀釋成1ml並在1ml標準比色杯中測定的吸光度為0.25，說明該50μL中含有0.25OD的DNA，也即說明原來1ml母液中含有5OD的DNA。
2.怎樣溶解引物？
我們的的合成報告單給出了每OD引物稀釋為100μmoL/L（即100pmol/ul）濃度的加水量，您可以根椐您的實驗需要加入適量的無核酸酶的雙蒸水（PH>6.0）或TE緩衝液（PH 7.5-8.0），開啟瓶蓋溶解之前最好在3000-4000轉/分鐘 的轉速下離心1分鐘，防止開蓋時引物散失。
3.合成的引物應如何保存?
沒有溶解的引物非常穩定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀釋為100μmoL/L的儲存液，分裝數份保存於-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反覆多次凍融會降低使用壽命）。使用前，將濃溶液稀釋成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）後進行實驗。
4.如何檢測引物的純度？
實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定濃度的聚丙烯醯胺凝膠進行電泳,<12個鹼基的引物用20%的膠，12-60個鹼基的引物用16%的膠，>60個鹼基的引物用12%的膠，取0.2OD左右的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素乾粉直到飽和，上樣前加熱變性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間後(約2-3小時)，剝膠，用螢光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的(有時由於變性不充分，主帶之上可能會有條帶，乃是引物二級結構條帶)。
5.一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基團嗎?
沒有，5'和3'末端均為-OH基。如需要加磷酸基團，訂貨時請特別註明，此時需收取磷酸化的費用。
6.合成的引物進行PCR反應時無目的帶，怎麼辦?
PCR反應失敗的原因很多，可以從以下幾個方面考慮。
1) 引物和模板是否配對，同源性有多大?
2) 引物本身是否有立體結構.
3) PCR反應用試劑是否能正常工作?
4) PCR儀是否工作正常?
5) PCR反應條件是否合適?
如果一切正常，還無法解決問題時，我們可以免費重新合成引物。
7.測定了引物的OD值後發現A260/A280<1.8，引物的純度合格嗎?
由於核酸在260nm附近有強吸收，而蛋白質在280nm附近有強吸收，從生物體內提取核酸時，常用A260/A280比值來評價核酸純度(比值在1.8～2.0之間)，這一判斷是基於序列中A、G、C、T所佔比例大致相同時的結果。而合成的DNA/RNA則不同，序列很短 (通常在20～30個鹼基之間)，其中A、G、C、T各種鹼基所佔比例很不相同，由於各種鹼基的摩爾消光係數不同，因此不同鹼基構成的引物的A260/A280比值也不同， 例如當序列中C、T鹼基的含量高時，該比值會大大低於1.8。所以不能用A260/A280的比值來判斷引物的純度.
8.上海生工公司可以合成多長的序列？
由於用戶和基因拼接的要求，我們很好地合成過不少100鹼基左右長度的長片段。因為我們可以提高起始合成數量、加大合成用的試劑量、用PAGE純化。如果您的實驗需要，我們願意接受110鹼基以下的訂單。
9.PCR產物經過克隆以後測序發現引物區與合成序列不相符合，怎麼辦？
我們認為這多數是PCR過程和克隆過程中引入的錯誤。遇到這種情況，請您：
1) 可以要求我們重新免費合成引物。
2) 重新挑取克隆測序，會有找到正確克隆的可能.
10.如何將兩條互補的單鏈退火形成雙鏈？
用退火緩衝液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA)溶解引物, 將要退火的引物等摩爾數混合，總體積不要超過500微升，加熱到95℃ 2mins，然後緩慢冷卻至室溫(低於30度)即可。退火的產物可以放在4度待用。
11.使用3%的Agarose凝膠電泳分析合成的引物，發現有很多條泳帶，為什麼?
對引物進行電泳一定要使用變性PAGE電泳。由於引物是單鏈DNA，容易形成複雜的立體結構，因此進行Agarose電泳時，容易出現多條泳帶，更無法用Agarose電泳進行定量了。
12.能否根據引物電泳後EB染色後條帶的亮度對合成的引物進行定量?
不能。因為EB是通過嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著色的。合成的DNA分子為單鏈，只有通過自身回折形成局部髮夾環結構或鏈間形成部分雙螺旋結構，才能被EB染色。由於不同引物的序列不同，形成雙螺旋的能力不同，因此染色能力不盡相同，也就不能根據EB染色帶的亮度來對合成的DNA進行定量。
13.2OD的引物可以多少做次PCR反應？
一般來講，20個鹼基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反應。
14. DNA合成粗產物中含有什麼雜質？
DNA合成儀合成的粗產物，其中除了含有所需的目的DNA片段以外，還含有合成反應過程中產生的目的片段短的失敗片段以及脫保護基團產生的銨鹽，本公司提供的引物已全部通過純化去除短片段、通過脫鹽去除鹽分。
15.引物在常溫下運輸，會降解嗎？
不會降解，乾燥的引物在常溫至少可以穩定存放二周以上。而一般的運輸時間通常都在1-3天，所以您收到的引物不會降解。
16.為何長鏈引物的收費要比短鏈引物要高？
通常在合成長鏈引物時，試劑的加入量要比短鏈引物要多很多，尤其是大於90bp的鹼基以上的引物，由於成本的增加，從而導致價格也要高一些。
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