來源：來源網絡 2007-01-14 21:07
寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA
一、試劑準備
1．3M醋酸鈉（pH 5.2）
2．0.1M NaOH
3．1×上樣緩衝液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配製時可先配製Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經高壓消毒後按各成分確切含量，經混合後再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。
4．洗脫緩衝液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS
5．無水乙醇、70%乙醇
6．DEPC
二、操作步驟
1．將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮於0.1M的NaOH溶液中。
2．用DEPC處理的1ml注射器或適當的吸管，將寡聚（dT）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。
3．使用1×上樣緩衝液洗柱，直至洗出液pH值小於8.0。
4．將RNA溶解於DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫後加入等體2×上樣緩衝液，混勻後上柱，立即收集流出液。當RNA上樣液全部進入柱床後，再用1×上樣緩衝液洗柱，繼續收集流出液。
5．將所有流出液於65℃加熱5min，冷卻至室溫後再次上柱，收集流出液。
6．用5-10倍柱床體積的1×上樣緩衝液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內含物為無Poly(A)尾的RNA。後部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。
7．用2-3倍柱容積的洗脫緩衝液洗脫Poly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。
8．OD260測定Poly(A+)RNA分布，合併含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。
9．4℃離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉澱。[注意：此時Poly(A+)RNA的沉澱往往看不到]。4℃離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾乾。
10. 用適量的DEPC H2O溶解RNA。
三、注意事項
1．整個實驗過程必須防止Rnase的汙染。
2．步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然後冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級結構，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結合，否則會導致rRNA的汙染。所以此步驟不能省略。
3．十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會阻礙柱內液體流動，若室溫低於18℃最好用LiCl替代NaCl。
4．寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反覆使用。每次使用前應該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩衝液洗柱。
5．一般而言，107哺乳動物培養細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當於上柱總RNA量的1%-2%。
RNA酶保護試驗((RNase Protection Assay,RPA)是通過液相雜交的方式,用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測RNA表達的技術。與Northern雜交和RT-PCR比較，RPA有以下幾個優點：
1． 檢測靈敏度比Northern雜交高。由於Northern雜交步驟中轉膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進行電泳，故損失小，提高了靈敏度。
2． 由於PCR擴增過程中效率不均一和反應「平臺」問題，基於PCR產物量進行分析所得數據的可*性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數據真實性較高。
3． 由於與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進行分析。
4． 步驟較少，耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉膜和洗膜的過程。
5． RNA-RNA雜交體穩定性高，無探針自身復性問題，無須封閉。
6． 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。
7． 檢測分子長度可以任意設置，靈活性大。
RPA的缺點是需要同位素標記探針。
一、試劑準備
1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。
2. 雜交緩衝液 IPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲醯胺8ml，加DEPC H2O至10ml。
3. RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml
二、操作步驟
1．反義RNA可由含T7或SP6啟動子的重組質粒為模板製備，也可以用含啟動子的PCR產物為模板製備，本文介紹後者。
（1）設計含T7啟動子的PCR引物
由於PCR產物將作為合成反義RNA的模板，所以一對引物中的下遊引物5』-端要含T7啟動子序列:
T7啟動子序列為：5』-TAATACGACTCACTATAGGG
引物設計的其他要求與一般PCR引物的設計相同。PCR產物的長度決定了反義RNA探針的長度，具體設計時可考慮100-400bp長。最好採用巢式PCR，即先擴增出一較長的片段，再以該片段為模板擴增出較短的片段，以保證探針的特異性，如下圖所示：
上遊引物
下遊引物Ⅱ T7 啟動子序列
下遊引物Ⅰ
（2）PCR
先用上遊引物和下遊引物Ⅰ進行PCR，再以PCR 產物為模板,用上遊引物和下遊引物Ⅱ-T7進行二次PCR(具體操作參見PCR章節)。
（3）探針合成標記與純化
在0.5ml 離心管中加入下列試劑：
RNasin （40U/μl） 0.5μl
GACU POOL GAC
（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM） 2μl
[α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μl
DTT (二硫蘇糖醇，0.1M) 1μl
5×轉錄 buffer 2μl
模板（50ng/μl） 1μl
T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl
混合後，短暫離心，37OC保溫1hr。
加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl, 37OC 15min, 然後75 OC 10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。
加入：飽和酚 50μl
氯仿 50μl
酵母tRNA（2μg/μl） 4μl
DEPC H2O 100μl
室溫下充分混勻，離心10000g×2min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100μl氯仿，混勻，離心10000g×2min。將上層液轉移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10μl、預冷無水乙醇250μl，混勻後，-20OC靜置30min。4OC離心13500g×10min。棄上清液，沉澱用75%乙醇100μl洗滌，4OC離心13500g×2min, 棄上清液。室溫下揮發殘留乙醇。加入50μl雜交緩衝液溶解沉澱，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測探針質量。（參見本節電泳步驟）。
2．雜交
（1） RNA提取後溶解在雜交緩衝液中，濃度為1μg/μl。
（2）取8μl RNA加入1-3μl探針（根據探針檢測結果調整）於0.5ml 離心管中。
（2） 80OC保溫2min，然後40-45OC下雜交12-18hr。
3. 消化
(1) 雜交管於37 OC保溫15min，加入RNase消化液，37 OC保溫30min。
(2) 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混勻，37 OC保溫10min。
(3) 加入65μl飽和酚和65μl氯仿，混勻，室溫離心，10000g×2min。
(4) 轉移上層液到另一0.5離心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl異丙醇，混勻後，置-20OC 30min，4 OC離心,135000g×10min。
(5) 棄上清液，室溫下揮發乙醇，加入5-8μl上樣緩衝液溶解沉澱。
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