RT-PCR實驗技術詳解

2021-02-20 生物學研究生大本營

抽提方法:TRIzol

1.取100mg小鼠肝組織,加入0.5 ml TRIzol試劑,用勻漿器打勻 (Trizol 預先放於冰上,充分打勻),轉移至ep管中。

2. 加入 0.5ml TRIzol 衝洗勻漿器,轉移至Ep管中,吹打混勻10次,室溫放置5 min。

3.  加入200 μl 氯仿,劇烈震蕩混勻15s,室溫靜置3 min。

4.12000rpm,4℃ 離心15 min。

5.將上清液小心轉移到新的1.5 ml離心管中,加入0.5ml異丙醇,上下顛倒幾次混勻,室溫下放置10min。(注意:不要吸取任何中間層物質,寧缺勿爛。) 

6. 12000rpm, 4℃ 離心10 min 。

7. 小心棄去上清液,防止RNA沉澱丟失。

8.用70%乙醇(DEPC處理的水配製)洗滌1次,加入

 1ml 乙醇,將RNA沉澱彈起,漂洗。(RNA於70%乙醇中非常穩定,-20℃可存1年)

9. 7500rpm,室溫離心10min。

10. 儘可能徹底地棄去上清,防止RNA沉澱丟失。

11. 真空離心乾燥3~5分鐘,或放在室溫下使乙醇完全揮發掉(不可過幹)。

12. 沉澱用20 μl DEPC-H2O溶解,如發現沉澱難溶,60 ℃處理10 min。

13. 測定RNA濃度與純度(A260/A280),分裝,-70℃保存,短期使用。 

注意事項

•TRIzol試劑含有苯酚,具有毒性和刺激性,操作時注意。

•操作過程中RNase汙染的主要來源是手和空氣中的浮沉,注意配帶手套,迅速操作,管蓋蓋嚴;點酒精燈。

•細胞裂解必需充分。裂解不完全會降低最後得率,因為一部分RNA會殘留在未裂解的細胞中。細胞裂解之後要看不見顆粒狀物質

 •裂解細胞時最好在低溫下操作,防止在操作過程中釋放的內源RNase降解了RNA。 

•吸取上清時,寧少勿濫(防止DNA/蛋白質汙染)。

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