恆溫核酸擴增反應引物探針設計問題合集

2020-08-27 基因獸

重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術（由英國公司開發）。以此為基礎的核酸擴增產品，能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術對硬體設備的要求很低，特別適合用於體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。

酶促重組等溫擴增（Enzymatic Recombinase Amplification，ERA），由蘇州先達基因科技有限公司（www.gendx.cn）開發，擁有全球自主智慧財產權，在低溫條件下(25-42℃)可對痕量的靶DNA片段進行特異性的擴增，在最適溫度35-40℃時，擴增反應時間僅需15分鐘，以此達到核酸快速檢測的目的。該技術同樣對硬體設備的要求很低，現已應用於研究診斷、公共衛生、食品安全、水產畜牧等各個領域。

RPA和ERA的擴增引物可以說是整個反應的關鍵所在，那麼怎樣才能設計好其引物呢？

1、RPA引物需要多長？

RPA引物一般在32至35個核苷酸之間。某些情況可能用到少於30個核苷酸的引物，但擴增過程會顯著減緩。

ERA 引物需要多長？

為了充分利用 ERA 的檢測速度和靈敏度，我們建議客戶使用 29-32 個核苷酸長 度的引物。通常情況下，PCR 引物可用於 ERA 反應體系，但這類引物的檢測速 度和靈敏度可能不及較長的引物。


2、RPA引物應當相距多遠？

這取決於你的具體應用。標準試劑盒適用於不超過500bp的擴增產物。RPA擴增產物的大小是沒有下限的，不過RPA引物一般需要擴增子超過80bp。擴增產物在100-200bp之間，可以實現最快的RPA擴增。

ERA 引物應當相距多遠？

一般而言，我們建議兩個 ERA 引物產生的擴增片段不應超過 300bp。ERA擴增片段的大小或許沒有下限，不過根據 ERA 引物最小長度，擴增片段的大小最小 約 80bp。為了獲得最快的檢測速度，最終的擴增片段長度應為 100-200bp。


3、RPA 我需要篩選多少引物？

這取決於你對檢測靈敏度的要求。舉例來說，如果目標分子上千，那麼絕大多數引物都夠用了。對靈敏度要求很高的話，最好是進行系統性的引物篩選。一開始篩選的時候，候選引物可以有10到20對。測試的引物越多，找到好引物的機率也就越大。

ERA 我需要篩選多少引物？

這取決於您對檢測靈敏度的要求。舉例來說，如果您只需要每個反應檢測 1000 個分子或以上，那麼大多數引物對都夠用了。對於極高靈敏度的檢測，最好是進 行系統性的引物篩選以找到好的 ERA 引物。最初篩選時，測試的引物條數通常 是正反向引物各 7 條。測試的引物越多，找到能夠檢測單個分子的好引物對的機率就越大。

引物設計

螢光型ERA產品探針設計

  1. 探針長度為 46-52 個核苷酸，其中至少 30 個位於 THF 位點的 5』端，另外至少 15 個位於其 3』端。
  2. 螢光團與淬滅團只能標記在胸腺嘧啶（T）上，且螢光團與淬滅團間距在2-5個鹼基。
  3. THF為替換位於螢光團與淬滅團之間的某鹼基，且dT-螢光團或 dT-淬滅團與 THF 之間的核苷酸數量可以是 0、1 或 2。
  4. 探針的3』端需加上阻斷基團


試紙型ERA產品探針設計

  1. 探針長度為 46-52 個核苷酸，其中至少 30 個位於THF位點的 5』端，另外至少15個位於其 3』端。
  2. THF為替換位於螢光團下遊30bp後與阻斷基團上遊15bp之間的某鹼基
  3. 螢光團只能標記在胸腺嘧啶（T）上。
  4. 探針的3』端需加上阻斷基團

探針設計

反應需要用多少引物？

基礎反應每次需要480nM引物，有時，稍微改動一下引物的用量可以提高其性能。對不同引物濃度進行測試（從200nM 到600nM）將有助於找到最合適的引物濃度。


反應需要用多少探針？

反應一般每次需要120nM探針。不過，略微改變探針的濃度有時會促進反應的進行。我們可以在一定濃度範圍內（從50nM到150nM），根據自己的具體應用對探針進行優化。


現成的PCR引物能用嗎？

RPA多半不行。絕大多數PCR引物不能用於RPA。

而通常情況下，PCR 引物可用於 ERA 反應體系，但這類引物的檢測速度和靈敏度可能不及較長的引物。


現成的PCR探針能用嗎？

不能。絕大多數常用的PCR探針並不適合RPA或者ERA反應。特別是用到了聚合酶5』-3』核酸酶活性的探針系統，這樣的酶活性完全不兼容。


篩選引物的時候必須用探針麼？

不一定。任何檢測方法都可以用來評估候選引物的性能。不過對於篩選高靈敏度引物來說，用檢測探針對擴增進行實時監控被證明是最快也最省力的方法。


引物篩選時應該用什麼樣的條件？

引物篩選的條件最好儘量模擬實際檢測時的條件，例如模板的拷貝數、樣本純度等等。


給定引物的性能還能再提高麼？

一般來說，稍微改動一下引物的序列可以提高其性能。任何給定的引物都可以通過以下方法進行優化：以單核苷酸為基礎略微改變引物的長度；或者保持引物長度不變，以1bp為基礎移動引物的位置。經過了改動的引物，需要重新進行擴增活性的測試。


RPA引物的熔解溫度應該是多少？

RPA和ERA反應是在常溫下進行的，DNA的解鏈與PCR有很大不同。傳統估算的熔點不適用於這個系統。


引物需要特別純化麼？

在進行引物篩選的時候，一般不需要純化。在其他情況下，引物的質量會造成批次間的差異。如果對一致性要求比較嚴格，最好先純化引物再進行RPA或者ERA反應。


使用引物和探針的時候還需要注意些什麼？

引物和探針需要同時添加到體系中，一先一後會使片段重組出現偏向性。


我該如何選擇探針？

如果使用適用於探針的其中一種試劑盒，需要注意的是，在標靶區域選擇探針位置時，有一些序列限制。如果存在不合理的限制，本公司可幫助您設計備選檢測 方案。


我如何配製凍幹引物、探針？

通常，用 TE（10mM Tris-Hcl pH8.0 0.1mM EDTA）來製備 100μM 的儲存溶液， 並長期儲存於-20℃。

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