ERA（酶促重組等溫擴增）技術常見問題解答

2020-08-27 基因獸

【ERA技術】

通過模擬生物體遺傳物質自身擴增複製的原理，將來源於細菌，病毒和噬菌體的特定重組酶、外切酶、聚合酶等多酶體系進行改造突變並篩選其功能，通過不同的核酸擴增反應體系進行優化組合，從而獲得核心的重組等溫擴增體系，在37-42℃恆溫條件下，可將微量DNA/RNA的特異性區段在數分鐘內擴增數十億倍，即（酶促重組等溫擴增，Enzymatic Recombinase Amplification）ERA技術方法。

酶促重組擴增（ERA）技術

1、ERA擴增試劑盒應在怎樣的溫度下使用？

標準的ERA擴增試劑盒經過配製可在37℃-42℃的溫度範圍內操作。過高的溫度會對反應體系產生不利的影響，因為酶會逐漸地失去全部活性。對於RT試劑盒，我們建議客戶在40℃下運行反應，因為逆轉錄酶在稍高溫度下具有更高的活性。


2、經過一種ERA擴增試劑盒測試過的引物，能直接用於其他ERA擴增試劑盒嗎？

不一定。如果您已設計篩選出ERA基礎型核酸擴增試劑盒的引物，用於ERA螢光型或ERA試紙型核酸擴增試劑盒時還需要引入探針。這個意味著跑膠檢測、螢光檢測或是測流層析檢測對引物的最佳組合可能有著不同的要求。通常情況下，使用相同的引物探針從ERA螢光型轉為ERA試紙型能獲得相當可靠的結果，此時ERA試紙型螢光信號強度會大幅度減弱，但不會影響靈敏度檢測。螢光檢測的最佳引物/探針組合不一定是跑膠檢測的最佳引物組合，反之亦然。從DNA檢測分析轉為RNA檢測的逆轉錄分析情況更複雜，因為逆轉錄酶對引物有著不同的偏好。就這一點而論，我們建議使用RT試劑盒在RNA模板上設計RNA檢測，而不是使用DNA試劑盒優化後的結果嘗試轉為使用RT試劑盒。


3、當我向擴增試劑中加入事先配製好的預混液時，擴增試劑變渾濁，這有問題嗎？

這對於ERA反應來說屬於正常現象，沒有問題。ERA反應會形成乳狀液，有時肉眼可觀察到此變化。


4、可以保存ERA擴增反應產物嗎？

可以，基礎型、RT-基礎型、試紙型或是RT-試紙型反應體系的擴增產物短期可以保存在4℃下，長期保存建議-20℃。但螢光型（RT）擴增產物不能保存。如果在反應結束後未經迅速失活處理，核酸酶會逐漸消化擴增產物。


5、可以對EAR擴增反應進行終點分析嗎？

可以，但不包括螢光型（RT）試劑盒。因為在反應結束後，未經迅速失活處理，核酸酶會逐漸消化擴增產物。要分析擴增產物，請使用基礎型（RT）或試紙型試劑盒進行跑膠檢測分析。


6、可以將激活劑添加至重懸試劑中嗎？

如果您在使用基礎型（RT）、試紙型（RT）反應體系時，是可以添加的。

不過一旦加入激活劑，反應體系立即被啟動。在最後添加激活劑時，我們建議將激活劑添加到8聯排反應管的蓋子上，並將其離心至反應體系中，這樣便可確保反應同時開始。

如果您在使用螢光型（RT）反應體系時，是不可以添加的。當體系裡面有激活劑存在時，引物和探針會受到核酸酶的破壞，便會導致反應中出現很高的螢光基線。


7、可以在反應體系中加入更多/更少的溶解劑嗎？

不可以。加入比建議更多或更少的溶解劑會對ERA反應的進行方式產生不利的影響。溶解劑中包含ERA反應所需的成分，因此加入更多或更少的溶解劑將會改變其在重懸試劑中的最終濃度。


8、可以製備預混液嗎？

可以。如果您想建立多個反應，可以製備預混液。在篩選不同的DNA時，可以將溶解劑、引物和探針（如果使用）混合在一起，並加到擴增試劑中重懸。然後將不同的DNA加入反應體系，最後照常激活劑啟動反應。在篩選不同引物時，可以將溶解劑、模板DNA、探針（如果使用）和一個引物製成預混液，並將其分裝到1.5ml小管後再分別加入不同的引物。只有當兩個引物都存在時，才能重懸擴增試劑，否則會使重組複合物的形成偏向先添加的引物。


9、跑膠之前需要純化EAR擴增產物嗎？

需要。ERA反應體系裡的所含試劑和蛋白會干擾正常的瓊脂糖凝膠電泳，如果不進行產物純化，跑出來的可能是彌散條帶而不是乾淨的條帶。


10、如果要運行ERA反應，需要哪種類型的儀器設備？

本公司有一款自主開發的GS8恆溫螢光檢測儀，簡單便攜。基礎型（RT）和試紙型（RT）適用於任何能保持37-42℃的穩定溫度的設備。對於使用螢光型（RT）試劑盒進行實時反應時，可使用能激發並檢測所用螢光基團（最佳激發波長為492nM，最大發射波長為520nM）並能保持37-42℃穩定溫度的儀器設備或實時熱循環儀，注意，在運行ERA反應時，蓋加熱功能應關閉。這裡推薦使用本公司自主開發的GS8恆溫螢光檢測儀，簡單便攜。也可使用ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等螢光定量PCR儀。


11、使用ERA擴增試劑時，我可以如何提高一致性和改善RNA靶基因的擴增？

如果模板RNA在添加到反應之前先與激活劑合併，這可能使RNA的三級結構穩定化，從而導致逆轉錄酶受到抑制。現將模板RNA添加到反應混合液中再添加激活劑，或相隔一段距離（即RNA與激活劑分別添加到反應蓋子的相對兩側）同時添加，這樣可提高性能。


12、出現假陽性的結果，可能的原因有哪些？

如果在無模板對照中觀察到假陽性結果，可能的原因主要有汙染或引物設計引起。

1）通常由汙染引起比較多見，現象為無模板對照或陰性對照的檢測結果顯示與陽性結果非常類似。以螢光檢測為例，具有擴增曲線，螢光值較高一般為陽性值相差不大。對此，我們建議區分試劑配製區和擴增分析區。在使用任何擴增後打開反應管的終點檢測方法時，必須採用嚴格的汙染控制措施。要排除或清除汙染，我們建議用消毒液或75%的酒精對工作區域進行消毒，並使用新的擴增試劑（溶解劑、激活劑等）。可能需要重複幾次清潔，才能徹底清除汙染。

2）引物設計問題導致，現象為無模板對照或陰性對照的檢測結果顯示與陽性結果有較大的差異。以新冠檢測為例，一般出峰時間較晚（在13分鐘以後），螢光Δ值較低，擴增曲線不明顯。針對此類問題，我們建議引物進行重新設計和篩選。

蘇州先達基因（www.gendx.cn）的具有全球自主智慧財產權的酶促重組擴增技術（ERA技術） （申請號：PCT201910262085.3） ，可實現在37~42℃恆溫條件下，10-15分鐘，將靶DNA/RNA特異性擴增數十億倍。

ERA擴增技術

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