摘要：為探索可靠、靈敏的轉基因動物及其產品檢測技術，從核酸檢測和蛋白檢測兩個方面，綜述了轉基因動物及其產品不同檢測技術的原理、特點及應用，提出了每種檢測技術的不足及今後轉基因檢測技術的發展趨勢和研究方向。目前，已經研發的核酸檢測技術主要包括多種PCR方法、環介導等溫擴增技術、Southern blot技術和染色體原位雜交技術等，蛋白檢測方法主要包括酶聯免疫吸附檢測技術、免疫層析試紙條、Western blot技術、免疫組織化學和免疫螢光技術等。三代測序技術是近年來提出的一種新型基因檢測技術，適用於對未知序列轉基因動物的分析。隨著轉基因技術的發展，轉基因動物及其產品越來越多，高通量、高靈敏度和低成本的檢測技術將成為未來轉基因動物及其產品檢測的研究重點。
隨著轉基因產品在理論和技術上的不斷完善，越來越多的轉基因動物及其產品被批准上市，逐漸走進人們的生活。美國GTC公司生產的用轉基因山羊奶研製而成的抗血栓藥物重組人抗凝血酶Ⅲ（ATryn），分別在2006年和2009年被歐盟和美國食品藥品管理局（FDA）批准上市；2010年10月，荷蘭Pharming公司生產的從轉基因兔奶中純化的一種人重組C1酯酶抑制劑（Ruconest）獲得歐洲藥品管理局（EMA）批准生產；2015年11月，美國FDA將轉生長激素基因三文魚送上人們的餐桌。
轉基因動物及其產品的主要優勢表現在提高動物生產性能、增強抗病能力、加快培育新品種，以及有利於建立疾病模型、生產醫療藥品和營養保健品、移植器官、保護環境等方面。目前，世界各國相繼建立了轉基因標識制度，公眾對轉基因產品安全的關注度也不斷提高，因此在進出口檢疫結果互認、農貿市場食品安全監管以及消除貿易壁壘等方面，需要可靠、靈敏的轉基因檢測技術。為幫助建立高通量、高靈敏度和低成本的轉基因動物及其產品檢測技術，從核酸和蛋白質檢測兩個方面，對當前主要的轉基因動物及其產品檢測方法進行綜述。
核酸檢測方法
定性PCR技術
PCR技術是目前應用最廣的檢測技術。根據檢測靶序列不同，PCR檢測技術分為篩查法、基因特異性法、構建特異性法和轉化體特異性法4類。
篩查法。該方法根據啟動子、終止子、標記基因及報告基因序列設計引物進行PCR擴增。在動物及其產品檢測中，最常用的基因包括，綠色螢光蛋白（green fluorescent protein，GFP），紅色螢光蛋白和新黴素磷酸基轉移酶II（neomycin phosphotransferase II，NTP II）編碼基因以及新黴素抗性基因（neomycin resistance gene，neoR）等。Huang等根據抗性基因neoR序列設計引物，通過實時定量PCR方法確定了轉基因細胞重組效率；Chen等利用慢病毒載體製備了DsRed1和Venus雙轉基因，根據紅色螢光蛋白編碼基因序列設計了長度為695 bp的引物，並對轉基因豬進行了確認。由於某些基因在自然環境中廣泛存在，使轉基因產品在檢測過程中易受到汙染，從而出現假陽性結果，所以該方法特異性較差。但在大規模樣品篩查時，通用檢測元件能節省時間，減少工作量，提高效率，所以該方法適合於轉基因動物及其產品的初步篩查。
基因特異性法。基因特異性法是以目的基因作為檢測靶標，在實際操作過程中，能夠獲取遠遠大於啟動子和終止子數量的基因數量，因而比篩查法更具特異性。Huang等針對豬β-防禦素2（porcine beta-defensin-2，PBD-2）基因設計引物，確定了使用CRISPR/Cas9和Cre/loxP系統生成無標記的轉PBD-2基因豬中PBD-2的相對mRNA表達水平；Chen等在檢測雙轉基因豬時，針對DsRed1和Venus基因分別設計1對特異性引物，通過PCR和RT-PCR方法分別在新生的11頭仔豬和10種器官中檢測到了這兩種基因；Cui等通過體細胞核轉移技術生產了hLF和hLZ雙轉基因豬，分別針對hLF和hLZ基因設計了3對和1對引物，用於鑑定hLF和hLZ雙轉基因豬。
構建特異性法。該方法將引物設計在轉化載體中具有完整表達目的基因能力的基因盒上，相較前兩種方法具有更高的特異性。但對於具有相同外源基因的轉基因動物，當選用相同質粒進行轉化後，用此種方法則無法鑑定。Huang等從轉基因豬後代豬耳組織中提取基因組DNA，根據轉基因靶向插入片段等設計了4對引物，對無標記的轉基因豬進行了進一步確認；Chen等採集耳朵和尾巴以及靜脈血，根據慢病毒載體重組序列中EF-1啟動子設計引物，對轉基因豬進行了確認。
轉化特異性法。在目前的技術條件下，外源DNA以隨機方式插入動物基因組中，這樣每個品系中外源DNA與寄主DNA結合位點和邊界序列是唯一的，所以根據邊界序列設計引物，可以鑑定出轉基因動物的品系。李曉琳等根據測定的邊界序列設計特異性引物，建立了肌肉生成抑制素（myostatin，MSTN）基因敲除豬的快速檢測方法；Yang等根據轉基因豬的PBD-2基因邊界序列設計引物，確定了PBD-2基因過表達豬的整合狀態。
巢式和半巢式PCR法
巢式PCR（nested PCR）與半巢式PCR（semi-nested PCR）是在普通PCR基礎上建立起來的一種PCR技術。巢式PCR對兩對PCR引物進行擴增：第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似，第二對引物稱為巢式引物，與第一次反應產物的序列互補。第二次PCR擴增產物為目的條帶。而半巢式PCR僅含一對半引物，即第一對引物中的一個引物和新設計的另外一個引物形成一對新的PCR引物。巢式PCR與半巢式PCR的優點在於：即使第一次擴增產生了錯誤片斷，第二次擴增也能在錯誤片段上進行引物配對，從而降低了假陽性出現的概率，並且大大降低了檢測下限，提高了檢測靈敏度。而正因為需要進行兩次PCR，所以第二次PCR擴增時易引起交叉汙染。此方法常與其他檢測技術聯用，如實時螢光PCR、Southern印跡分析（Southern blot）等。Ma等通過巢式PCR和Southern blot，對原核顯微注射方法產生的轉基因小鼠進行了轉基因整合鑑定。
多重PCR法
多重PCR與普通PCR原理相同，主要區別在於其在一個反應體系中加入一對以上的引物，如果存在特異性的DNA模板，則它們能結合在與DNA模板相對應的部位，在同一反應體系中擴增出一條以上的目的DNA片段。多重PCR既具有普通PCR的特異性和靈敏性，也同時具有經濟快捷的特點。但因存在多對引物，各反應間存在相互抑制，所以該方法在實際過程中需要進行反覆優化摸索。
馬馨等根據轉入基因載體結構分別設計賴氨酸基因、NPT II、轉基因啟動子及小鼠基因組內參基因特異性引物，建立了轉基因小鼠多重PCR檢測方法。李全芬等成功建立了牛線粒體16S rRNA基因以及NPT II、人乳鐵蛋白和人-α-乳清蛋白編碼基因等轉基因的多重PCR檢測方法，並將其用於轉基因奶牛外源基因的快速檢測。李曉琳等根據豬β2-微球蛋白（β2-microglobulin，B2M）基因、NPT II基因和測定的邊界序列設計特異性引物，建立了MSTN基因敲除豬的多重PCR方法。
實時螢光PCR法
實時螢光PCR技術是在普通PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號的積累實時監測整個PCR進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的一種方法。其在轉基因檢測中發揮著不可替代的作用。實時螢光PCR實現了PCR從定性到定量的飛躍，與常規PCR相比，具有特異性和靈敏性更強、無汙染，能實現多重反應的特點。但當轉基因拷貝數較低或者與所轉基因動物同源性較高時易出現假陽性，且只能針對已知序列的轉基因動物及其產品進行引物設計。
Zhang等使用實時螢光PCR等方法確定了轉基因山羊系GHcd-2和GHcd-7基因的拷貝數為12.95±0.18和12.24±1.12；Pu等建立了NF-κB的A20結合抑制劑（A20 -binding inhibitor of NF-κB，ABIN1）的骨髓細胞條件轉基因小鼠，利用RT-PCR測定了促炎細胞因子的mRNA水平；Ge等通過實時螢光PCR發現鈣蛋白酶3（calpain3，CAPN3）在轉基因牛的骨骼肌和骨骼肌細胞中高表達，同時發現MyoD和CAPN3的mRNA表達水平在骨骼肌細胞分化過程中呈正相關；Cui等對hLF和hLZ雙轉基因豬的表達量進行了測定，結果發現每個轉基因陽性的hLF插入片段為3.4±0.3，hLZ為2.4±0.8。
熱不對稱交錯PCR技術
熱不對稱交錯PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）是非酶連PCR介導的基因組步移的典型方法。其基本原理是，根據目標片段的已知序列區域設計嵌套的特異引物（special primer，SP），然後將它們分別和一個具有低退火溫度、短的任意簡併引物（arbitrarydegenerate primer，AD）聯用，根據引物長短和特異性差異設計不對稱循環溫度，並通過三級PCR擴增反應得到特異性產物，最終對產物進行測序獲得T-DNA 插入位點的側翼序列。TAIL-PCR操作簡便、成本低，只要設計好幾對引物，就可以用基因組DNA作模板，直接篩選到目標序列。但正因為此方法為連續的嵌套反應，所以若其中一輪出現失誤，就會直接影響下一輪工作。
Zhang等對轉基因山羊系的兩個整合位點，利用TAIL-PCR進行鑑定，發現其分別位於染色體3和11中；Lin等利用體細胞核移植生產了4隻轉基因山羊，利用改良的TAIL-PCR法鑑定出了轉基因的4個整合位點，分別位於2、11、16和18號染色體上；Luo等對AQP2-Cre轉基因中國小型豬系，通過高效TAIL-PCR和絕對定量實時PCR在各種組織中檢測到了6個整合位點和12~14拷貝的Cre基因。
環介導等溫擴增技術
環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）針對靶基因特定區域設計特異性引物，利用一種鏈置換DNA 聚合酶在等溫條件下保溫30~60 min，完成核酸擴增反應。檢測限可達0.01%，甚至可檢測單拷貝的目的序列。在LAMP技術產物檢測方面，通常通過凝膠電泳、螢光染料或擴增副產物焦磷酸鎂沉澱進行。與傳統PCR 技術相比，該技術無需昂貴的PCR 儀，只需恆溫即可實現靶模板的擴增，擴增效率高、耗時短、操作簡便，而且產物肉眼可見，適合於現場和試驗條件較簡單的實驗室進行快捷檢測。但該技術的反應產物是一系列大小不同的擴增片段，無法直接進行測序和克隆，同時容易產生非特異性擴增。
李津等針對轉基因豬的標記基因hCD39建立了LAMP方法。該方法可最小檢測到3 fg/μL，並且可以對豬活體進行無損傷採樣檢測，適合現場快速簡便操作。Tao等建立了轉sFAT-1基因豬的LAMP檢測方法，其檢測限可達1.26 fg/μL。針對HBsAg和hATIII基因，Tao等設計一組4個引物，建立了檢測轉基因山羊的LAMP方法。
Southern blot 技術
自1975年英國科學家Southern 創立Southern blot技術以來，該技術已成為檢測特定DNA片段的經典雜交方法之一。其主要通過已知DNA來檢測未知樣品中的核酸順序，若含有外源基因序列片段便可以發生雜交，形成帶有標記的特異性雜交體，最後根據探針的標記結果進行檢測。Southern blot技術準確、靈敏，可同時定量檢測外源基因的拷貝數。Southern blot技術在科研領域中較為常用，準確度高，但存在試驗過程複雜、耗時長、需要特異探針、不易於大規模檢測的缺點。
Chae等將2C T細胞受體（T cell receptor，TCR）導入缺失Vβ13啟動子的突變小鼠（P13小鼠）建立了2C TCR轉基因小鼠，並使用Southern blot方法鑑定了2C轉基因的整合位點；Chen等利用慢病毒載體通過雌性種系製備了雙轉基因仔豬，通過Southern blot方法檢測到3~5個拷貝的轉基因已整合到第二代基因組中；Cui等通過PCR和Southern blot方法證實了hLF和hLZ雙轉基因豬的基因整合；Ma等對來自尾巴和組織的DNA進行Southern blot檢測，對基於Cre-lox的轉基因小鼠群體進行基因分型，並檢測了組織特異性Cre重組效率；Nagaya等構建了對螢光蛋白抗原具有免疫耐受性的轉基因克隆豬，並利用Southern blot方法對轉基因的拷貝數進行了測定；Huang等採用Southern blot方法進一步確認PBD-2插入了豬基因組，同時存在2個PBD-2基因位點的特異性整合。
染色體原位雜交技術
染色體原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是Gall和John兩個小組於1969年發明的，能直觀、簡便地確定轉基因動物外源基因在染色體上的位置。從最初用同位素標記探針的原位雜交技術發展形成了包括生物素原位雜交、螢光原位雜交和基因組原位雜交的結合分帶技術，逐漸形成了一系列較為完善的技術系統。應用FISH研究轉基因動物外源基因整合及其效應的關係，一方面為外源基因定點整合研究提供了參考，另一方面也為深入探討外源基因整合所導致的生理變化等理論研究打下基礎。但該技術過程繁瑣，只適用於定量，且在應用較短的cDNA探針時，效率不高，這是其使用過程中的常見問題。
Bou等將FISH分析與常見的預篩選工作流程結合起來，為轉基因公豬提出了一個3步驟的預篩選程序。此程序也可用於其他轉基因大型動物，從而為種群擴展提供了一種經濟有效的策略。孫淑娜等在觀察二氫葉酸還原酶基因（dhfr）表達對乙醇致斑馬魚胚胎心臟和血管發育異常的作用時，通過胚胎整體原位雜交檢測了胚胎nkx2.5、tbx1、flk-1基因的表達情況。
數字PCR技術
數字PCR通過將DNA模板稀釋幾十甚至幾萬倍之後，將其分配到不同的反應單元，從而使得每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子（DNA模板），然後在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結束後對各個反應單元的螢光信號進行統計學分析。與傳統定量PCR技術相比，數字PCR不依賴於擴增曲線的循環閾值進行定量，不受擴增效率影響，可實現絕對定量分析，具有更高的準確性和靈敏度。但數字PCR儀器昂貴，而且所用試劑、耗材成本高，不適用基層現場使用。
Nakagaki等利用數字PCR技術成功對過表達Necdin基因組的轉基因小鼠中的Necdin基因進行了測定，結果發現儘管轉基因小鼠中存在Ndn基因的兩個拷貝，但Ndn的表達幾乎等於內源性Ndn的表達，表明內源性Ndn的轉錄調控與轉基因之間存在相互作用。在轉基因小鼠FVB/NJ-Tg（ORAI1）Ibd的老齡動物中，Majewski等用數字PCR方法發現它們當中發生癲癇樣事件的概率可能與aristaless相關同源盒（aristaless related homeobox，Arx）的表達量下調有關。為了估計小鼠基因組中細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）轉基因的拷貝數、基因組組織和插入位點，Nakagaki等建立了數字PCR和反向PCR檢測方法。
蛋白檢測方法
酶聯免疫吸附檢測技術
酶聯免疫吸附檢測技術（enzyme Linked Immunosorbent Assays，ELISA）將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，然後用洗滌法將液相中的游離成分洗除，從而達到檢測相應抗原和抗體的目的，用於轉基因動物基因表達的靶蛋白質水平的分析測定。ELISA法適用於大規模樣品檢測，但對目的蛋白質結構要求高，不能檢測不同物種的同一蛋白質。
Pu等在ABIN1骨髓細胞條件轉基因小鼠中，通過ELISA測定了促炎細胞因子的蛋白水平；Cui等利用ELISA方法對hLF和hLZ雙轉基因豬的蛋白表達量進行了檢測，結果發現hLF的表達量為6.5 g/L，hLZ為1.1 mg/L；Yu等通過體細胞介導的轉基因克隆，生成了在乳汁中表達hLZ的轉基因山羊，通過ELISA分析發現，在自然泌乳期間，轉基因山羊乳汁中分泌的hLZ高達6.2 g/L，約為人乳的5~10倍。
免疫層析試紙條
免疫層析試紙條有濃縮的「ELISA」之稱。該方法快速、簡便，不需要任何特殊儀器設備，不需要使用放射性同位素或有潛在致癌物質的酶顯色底物，也不苛求熟練的操作技術，結果判斷直觀，特別適合於現場快速檢測。但該方法在實際應用過程中檢測靈敏度偏低，對經過加工的轉基因食品，因靶蛋白質結構改變而不能被抗體識別。
Tao等通過製備兩種針對人α-乳白蛋白（α-LA）的單克隆抗體，研發出能檢測轉基因牛奶和非轉基因牛奶的膠體金免疫層析法；Liu等研發了兩種用於檢測轉基因牛奶中的hLF蛋白的競爭法膠體金試紙條：一種是用膠體金標記hLF 蛋白，另一種是膠體金標記抗hLF 蛋白的多克隆抗體。當用於檢測轉基因牛奶時，兩種試紙條的檢測限均為10 μg/mL。
Western blot技術
Western blot即蛋白質印跡法（WB），其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色，通過分析著色的位置和深度，獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息，具有分辨力高、特異、敏感等多種優點。與Southern blot類似，該方法在檢測過程中同樣存在檢測時間長、檢測通量小的缺點。
Pu等通過WB對ABIN1骨髓細胞條件轉基因小鼠信號傳導蛋白的表達進行了確定。在研究胰內胰蛋白酶原的過早活化是否為急性胰腺炎的起因時，Malla等對轉基因輕鏈3（light chain 3，LC3）-GFP自噬報告基因小鼠中，由輕油黴素誘導的胰腺炎進行了前12 h的分析，通過WB發現螢光自噬體從胞質LC3-I變為膜性LC3-II。Cui等通過WB確定了hLF和hLZ雙轉基因豬均在其乳腺中表達了相應基因。Nagaya等創建了對螢光蛋白抗原具有免疫耐受性的轉基因克隆豬，發現表達修飾的Plum克隆豬的細胞和組織不發螢光，用WB和免疫組織化學分析發現，表達修飾的Plum與未修飾的Plum具有相同的抗原性。何祖勇等對共表達3種纖維素降解酶的轉基因小鼠進行WB檢測，結果在胃組織中未發現3種外源蛋白，而在大腸、小腸組織樣品中則有明顯的3種外源蛋白條帶。
免疫組織化學技術
免疫組織化學（immunohistochemistry）又稱免疫細胞化學，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位，通過抗原抗體反應和組織化學呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項技術。但該方法在切片製作過程中易脫片，存在非特異性染色假陽性的缺點。
何祖勇等利用原核顯微注射技術獲得同時表達3種纖維素降解酶的轉基因小鼠，通過免疫組織化學法，對舌、食道、胃、十二指腸、空腸和大腸等樣品進行檢測，發現3種纖維素降解酶主要在舌、十二指腸和大腸3個部位表達；Huang等利用免疫組織化學法檢測發現，轉基因豬不同器官中PBD-2基因均高表達，呈棕色信號，而野生型豬組織中未見明顯的棕色，這與免疫螢光和RT-qPCR鑑定結果相吻合；何賢等運用F59小鼠單克隆抗體對斑馬魚pax2a轉基因品系進行免疫組化試驗，結果發現綠色螢光蛋白在3體節時期就可以標記出中間中胚層，並在後續體節時期的中間中胚層前端（第3體節至第5體節對應的部分）及24 hpf 的腎管前端和中段表達。
免疫螢光技術
免疫螢光技術（immunofluorescence technique）是用螢光標記的抗體或抗原與被檢樣品中相應的抗原或抗體結合，在顯微鏡下檢測螢光，並對樣品進行分析的方法，實現了對抗原或抗體的定位，同時還可利用定量技術對樣本進行定量。但該方法因試驗過程中使用的是螢光抗體，其結果的讀取需在較短時間內進行。
Yang等通過間接免疫螢光方法驗證了豬PBD-2基因在pcCAG-PBD2轉染細胞的細胞質中過表達；Huang等利用自製的小鼠抗PBD-2單克隆抗體，通過免疫螢光方法對轉基因豬的PBD-2基因表達水平進行了檢測，發現PBD-2基因在不同組織中的表達水平均明顯高於其野生型同窩仔豬的表達水平；Ge等通過免疫螢光方法，對牛骨骼肌細胞中MYHC和MyoD分化0、1、3、5和7 h後的表達量進行了鑑定。
發展中的新技術
三代測序技術（third-generation sequencing，TGS）是近年來提出的一種新技術。它可以對DNA片段進行大規模測序。三代測序技術的典型特點是單分子檢測，以長讀長為優勢，實現了對鹼基序列的實時讀取，測序時間得以縮短。目前使用最多的是單分子實時測序技術和ONT納米孔單分子測序技術。三代測序在基因組重複區域或結構變異等領域具有非常明顯的優勢，適用於對未知序列轉基因動物的分析。
展望
隨著轉基因技術的發展，轉基因動物及其產品越來越多，建立高通量、高靈敏度和低成本的轉基因動物及其產品的檢測技術成為未來發展的趨勢。對於轉基因動物傳統檢測方法的改進，研究重點主要是擴大檢測方法的檢測限及定量限，即提高檢測方法的檢測範圍及精度。新的轉基因技術，如RNA幹擾、TALE核酸酶和CRISPR/Cas技術，給轉基因動物及其產品檢測帶來了新的挑戰。目前轉基因植物的檢測技術已形成相對完善的檢測體系，比如重組酶聚合酶擴增法（recombinase ploymerase amplification，RPA）、交叉引物擴增技術（cross priming amplicification，CPA）和依賴核酸序列的擴增技術（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）已經應用於轉基因植物的檢測研究中，生物傳感器也是轉基因植物檢測方法的重要一部分。而轉基因動物檢測技術相對於轉基因植物起步較晚，因此適度借鑑和效仿轉基因植物檢測技術不失為一種明智的選擇。