摘要：布魯氏菌病的早期診斷及鑑定是該病防控的重要環節，其診斷技術主要包括細菌學診斷技術、血清學診斷技術以及分子生物學診斷技術。布魯氏菌病防控應堅持預防為主的策略，其免疫主要以弱毒活疫苗為主，隨著分子生物學及重組DNA技術的發展，基因工程疫苗成為近年研究熱點，但目前尚未有鑑別疫苗免疫和自然感染的鑑別診斷技術及相應的疫苗製品。本文對布魯氏菌病的病原學、流行病學、診斷技術和疫苗研究進展等方面進行概述，以期為建立靈敏性高、特異性強、高效便捷且易推廣的布魯氏菌病診斷技術和研發更加安全有效的布魯氏菌病疫苗提供基礎。
布魯氏菌病（Brucellosis），簡稱布病，是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種人獸共患傳染病，以發熱和流產為主要特徵，流行於170多個國家和地區，對畜牧業發展和人畜健康構成較大威脅，我國將其列為二類動物疫病。本文重點介紹布病的病原學、流行病學，及診斷技術和疫苗的研究進展，旨在為布病的防控政策和淨化措施的制定、新的診斷技術和疫苗的開發提供參考。
病原學
布魯氏菌是革蘭氏陰性兼性厭氧菌，屬兼性胞內病原體。根據其生化特性、抗原成分、宿主特異性和對宿主致病性將布魯氏菌分為10個種，包括羊種布魯氏菌、綿羊種布魯氏菌、牛種布魯氏菌、豬種布魯氏菌、犬種布魯氏菌、沙林鼠種布魯氏菌、田鼠種布魯氏菌、鯨種布魯氏菌、鰭種布魯氏菌以及從人類乳腺中分離到的人布魯氏菌。
羊種、綿羊種、牛種、豬種、犬種和鼠種布魯氏菌為經典種，共有20個生物型，即羊種布魯氏菌（3個生物型），綿羊種布魯氏菌，牛種布魯氏菌（9個生物型），豬種布魯氏菌（5個生物型），犬種布魯氏菌、沙林鼠種布魯氏菌各1個生物型。經典種中羊種布魯氏菌對人類的感染性最強。布魯氏菌對外界環境抵抗力較強，但對熱和一般化學消毒藥比較敏感。
流行病學
布病主要流行於中東、拉丁美洲、亞洲、非洲和地中海盆地等牛羊養殖集中但經濟技術相對落後的地區，每年約有50萬新發人間病例，造成的經濟損失約30億美元。2004—2015年，我國家畜布病發病率居高不下，發病家畜主要以綿羊和牛為主，發病數量較多的省份有內蒙古、新疆、陝西、山西、湖北、山東和黑龍江等，其中內蒙古最為嚴重。
近年來，隨著我國家畜飼養量的增加，人間布病發病數呈快速上升趨勢。據國家衛健委官網信息，2019年1—10月我國共報告布病發病40743例，死亡1例，國內布病發病總數已超2018年全年。農業農村部、國家衛生計生委印發了《國家布魯氏菌病防治計劃（2016—2020年）》，為布病防控確立了目標並制定了原則和策略，不斷推進全國布病防治、監測和淨化，但受疫源分布廣、活畜流動性大、基層防疫體系薄弱、淘汰病畜難度大、防治經費投入不足等因素影響，我國布病疫情仍然嚴重，防控形勢十分嚴峻。
布病的傳染源主要是患病動物和帶菌者（包括野生動物），此外被布魯氏菌汙染的土壤、水源、病畜肉以及乳汁都可造成人畜的感染。本病的易感動物範圍廣泛，主要包括羊、牛、豬、犬、馬、鹿、駱駝和鼠等，同時人也易感；傳播途徑主要包括皮膚黏膜、消化道、呼吸道等。本病潛伏期短則一周，長則數月甚至半年以上。感染本病的母畜主要臨床症狀為妊娠後期發生流產、早產、弱胎或死胎；感染公畜臨床表現為睪丸炎、附睪炎和運動障礙；人感染布病的潛伏期為2周左右，初期症狀與流感類似，主要表現為持續發熱、多汗、無力和關節疼痛等，後期可能出現關節炎，嚴重者喪失勞動能力。
診斷技術研究進展
細菌學診斷技術
布魯氏菌的分離培養是診斷布病的最基礎方法，也是檢測布病的「金標準」。但由於布魯氏菌對環境和營養要求較高，還受動物感染階段、樣本中病原體數量及檢測前抗生素使用等因素影響，常導致細菌汙染，不能及時做出診斷而使病情加重。
布魯氏菌的分離培養操作過程複雜，需要專業技術人員在生物安全三級以上實驗室操作，分離操作過程存在較高的生物安全風險。因此，布魯氏菌的分離培養一般不用於現場疫情的篩查和臨床快速檢測，僅用於個別動物的輔助診斷和流行病學追蹤調查等。
血清學診斷技術
目前布病的血清學檢測種類較多，但在國際上尚未有標準方法，常用的有常規血清學試驗、補體結合試驗（CFT）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和螢光偏振試驗（FPA）等。
常規血清學診斷技術。試管凝集試驗（SAT）、虎紅平板凝集試驗（RBPT）和全乳環狀試驗（MRT）是3種常用的血清學試驗。SAT於1897年開始應用，目前在發達國家已經停用，但在我國仍然是使用廣泛的布病檢測方法，該方法對IgM、IgG敏感性較高，可用於布病的早期診斷，也可用於疫苗免疫抗體的檢測，對急性布病也有較好的檢測效果。但該方法操作相對繁雜、耗時較長，不適用於現場快速檢測。李翠等將SAT改進為微量試管凝集試驗（MSAT），具有稀釋方法簡便、省時省力、節約抗原血清等優點。RBPT是一種經典的血清凝集試驗，其抗原是將滅活布魯氏菌菌體經虎紅染料染色後懸浮於pH為3.7左右的乳酸緩衝液中製成。該方法敏感性較高、價格便宜、操作方便、檢測快速，但特異性和準確性一般，受試驗溫度和凝集時間影響，不易準確判定結果，故常用於動物群體布病的普查和人布病的初篩及監測，而不作為確診試驗。MRT主要通過檢測乳樣中的布魯氏菌抗體來篩查泌乳期牛群的布病，其本質是抗原抗體反應，當奶樣中存在布魯氏菌抗體時，與染成紅色的布魯氏菌抗原形成抗原抗體複合物，轉移至乳脂層形成紫紅色乳脂環。此方法操作簡便、成本較低，常用於奶牛布病的現場篩查，但其敏感性較差，如檢測牛群的大量乳樣或者奶樣中含有初乳時，可能導致假陽性反應。
補體結合試驗（CFT）。CFT相對於常規血清學檢測方法，具有敏感度高、特異性強的特點，是目前布病血清學診斷中最準確的方法之一。此外，CFT是國際貿易指定試驗，也是世界動物衛生組織（OIE）公認的確診方法，廣泛應用於牛、羊、人布病的診斷，由於豬自身補體能干擾豚鼠補體，因此不適用於豬布魯氏菌的檢測。CFT的缺點是對試驗條件要求較高、操作過程繁瑣、檢測結果受主觀因素影響較大，因此不適用於基層和現場檢測。
酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。ELISA方法的特點是簡便快速、特異性強、所需樣品少且過程易標準化等，不僅可以用於大量樣本的篩查，也可作為確診試驗。ELISA是國際貿易指定試驗，於2004年被OIE列為診斷牛種布病的推薦方法。但是ELISA成本較高、對試驗條件要求高，需在國家生物二級實驗室內進行，不適用於基層和現場快速檢測。
螢光偏振試驗（FPA）。FPA通過將螢光素標記的小分子抗原加到待檢血清或其他可能存在抗體的液體中，若存在相應抗體，抗體與標記抗原結合後會降低轉速，通過儀器測量減速便可確定相應抗體的存在。FPA方法屬於同源性分析，無需將分離物分離，因而簡便快捷，是國際貿易指定試驗。FPA診斷布病的敏感性和特異性與cELISA相近，但檢測更快速，可在2min（血清）或15s（全血）內測定抗體含量。FPA在某些發達國家已經大量應用，成為檢測動物布病快速、高通量的新技術，主要用於動物群體布病的檢疫、篩查和淨化。
分子生物學診斷技術
PCR檢測技術。PCR技術因其檢測特異性強、靈敏度高、操作簡便等優勢而在布病的檢測和種型鑑別等方面應用日益廣泛。目前主要的PCR方法有常規PCR、多重PCR、實時螢光定量PCR等。20世紀90年代常規PCR開始用於布病的診斷，該方法靈敏度高、特異性強，檢測時間相對較短，可用於大量樣品的檢測。常規PCR可以作為人布病的常規檢測方法，適用於臨床症狀明顯但血清學檢測為陰性的患者。多重PCR在同一反應體系內，加入2對或2對以上的引物，可以同時檢測多種病原，除了具有靈敏度高、特異性強的特點外，還有準確性高、經濟便捷等優點。實時螢光定量PCR是目前確定樣品DNA拷貝數最敏感、最準確的方法之一，實現了DNA或RNA模板的精確定量，具有高度特異性、敏感性和可重複性。相比其他PCR方法，實時螢光定量PCR操作簡便、不需電泳步驟，縮短了檢測時間。但由於實時螢光定量PCR所需設備及試劑比較昂貴、對試驗人員技能要求較高，不適用於基層推廣。
環介導等溫擴增技術（LAMP）。LAMP診斷布病，是針對布魯氏菌的特異性基因序列設計引物，通過先擴增再分析的模式進行病原檢測。但LAMP技術不需要苛刻的試驗條件和專業的儀器設備，其結果判定通過肉眼可直接觀察，整個檢測過程可在1 h內完成，適合在布病的基層防控工作中使用。
疫苗研究進展
布魯氏菌疫苗的研究最早開始於20世紀，早期曾使用滅活疫苗用於人和動物的布病防控，後被免疫效果更好的弱毒疫苗取代。至今，尚無國際認可的針對人類的布病疫苗，很多國家對人類使用疫苗免疫存在異議。目前對於動物布病的防控，主要使用的是弱毒活疫苗。此外，基因缺失疫苗、DNA疫苗以及重組亞單位疫苗等新型疫苗處在研發試驗階段。
弱毒活疫苗
因活疫苗可以有效刺激機體產生細胞免疫應答，產生持久良好的保護效果，因此目前大部分成功應用的疫苗均為弱毒活疫苗。如牛種布魯氏菌S19疫苗、粗糙型牛種布魯氏菌RB51疫苗、羊種布魯氏菌Rev1疫苗和豬種布魯氏菌S2疫苗等。
牛種布魯氏菌S19疫苗。S19疫苗在我國稱為A19疫苗，主要用於奶牛的布病預防。S19菌種最初是1923年從美國一牛場分離並通過實驗室培養而獲得。目前國際上使用的S19疫苗是由美國科學家篩選到的對赤蘚糖醇敏感的菌株，由於菌株ery基因缺失，使毒力進一步減弱、安全性更高。S19疫苗的生產和使用需要穿戴必要的防護裝備，但近年來仍有疫苗生產和接種過程中造成人員感染的事件發生。因此，對S19疫苗的研究方向主要是對其進行基因改造，既保留其免疫原性又能降低其毒力。
粗糙型牛種布魯氏菌RB51疫苗。RB51疫苗菌株是19世紀80年代末由美國科學家研製的粗糙型突變株。RB51疫苗對牛的安全性比S19疫苗高，但對懷孕母牛靜脈注射疫苗仍可引起25%的個體出現早產現象，且仍能造成人的感染。此外，RB51菌株具有利福平抗性，而利福平卻是治療布病最有效的藥物之一，因此RB51疫苗的使用不利於布病的抗生素治療。
羊種布魯氏菌Rev.1疫苗。Rev.1疫苗菌株是美國科學家將羊種布魯氏菌6056野毒株在鏈黴素抗性培養基上反覆傳代獲得的光滑型變異株，主要用於綿羊及山羊的布病防控。Rev.1疫苗相比S19疫苗提供的免疫保護更強，抗體持續時間更長，但其毒力也比較強。研究表明，採用黏膜免疫方式接種Rev.1疫苗可以到達與皮下接種相近的免疫效果。但黏膜免疫方式的開放性，增加了操作人員感染風險。
豬種布魯氏菌S2疫苗。S2疫苗菌株是中國獸醫藥品監察所由進口母豬流產胎兒中分離的布魯氏菌，經傳代培養獲得的光滑型弱毒株。S2疫苗毒力較S19和Rev.1疫苗弱，對羊、牛、豬均能產生良好的免疫保護，其最大的優點是通過口服接種方式不會引起母畜流產。S2疫苗除口服免疫方式外，還可以通過肌肉注射、皮下注射和黏膜免疫等方式接種羊、牛、豬以及犛牛等動物，但注射方式不能用於牛、小尾寒羊和懷孕母畜。
新型疫苗
隨著分子生物學及重組DNA技術的發展，研發新型疫苗成為近年來的研究熱點。
基因缺失疫苗。基因缺失疫苗的安全性高，因其遺傳背景清楚，可以通過病原學和血清學方法區分疫苗免疫和野毒感染。目前鑑定出的布魯氏菌毒力基因已經超過180個，這為基因缺失疫苗的研製奠定了基礎。研究結果表明，疫苗產生的保護力與其毒力正相關。因此在疫苗研發過程中，可以綜合考慮疫苗的安全性、毒力及保護力等因素，對分離野毒株、強毒株進行基因缺失或者對現有活疫苗進行優化。
DNA疫苗。布魯氏菌屬於胞內寄生菌，機體的細胞免疫是控制其感染的關鍵，因此布病DNA疫苗的候選分子主要為能刺激T細胞引起細胞免疫的分子。DNA疫苗缺點是免疫效果差且單獨使用不易誘導產生特異性免疫應答，其用於人和動物的具體效果還有待驗證，目前尚無DNA疫苗能完全取代弱毒苗。
重組亞單位疫苗。重組亞單位疫苗與傳統疫苗相比，具有安全性高、抗原成分單一、常規血清學方法可以鑑別等優點。2010年Kazak等利用L7/L12製備的亞單位疫苗在臨床上誘導了Th1型免疫應答，但重組亞單位疫苗研發成本較高、生產工藝複雜、免疫效果不佳。為增強免疫效果，可將幾個蛋白或多個有效的多肽進行重組，該方法可以提高其免疫原性、增強其免疫效果。目前布魯氏菌重組亞單位疫苗用於動物免疫的試驗不多，研究尚處初級階段。
討論
目前，全球範圍內布病疫情呈反彈趨勢，隨著畜牧業的集約化發展，以及牛羊及其產品的跨區域頻繁調運，我國布病疫情雖然維持相對穩定水平，但每年總體發病數量仍然較高。國內外針對布病的診斷技術方法較多，目前主要採取多法並存、相互補充的方式，尚無能夠獨立確診布病的方法。此外，建立能夠區分疫苗免疫與自然感染的布病鑑別診斷技術對於布病的淨化及控制具有較為重要的意義。
布病的防控要堅持免疫預防為主的策略，但現有疫苗各有優缺點，難以完全控制疫情發生，部分疫苗還會干擾後期實驗室診斷。隨著分子生物學技術的發展，在對布魯氏菌致病性及免疫原性深入研究的基礎上，期待能夠出現靈敏性高、特異性強、高效便捷且易推廣的診斷技術。同時加強各類新型疫苗研發，研製出安全性高、副作用低、免疫效果好的疫苗，為布病的控制和淨化服務。