3限制酶的DNA識別序列一定為迴文序列嗎？
DNA 中的一段倒置重複序列 ，當該序列的雙鏈被打開後，可形成髮夾結構，這段序列被稱為迴文序列。 其特點是在該段的鹼基序列的互補鏈之間正讀反讀都相同（並非在同一條鏈上正讀反讀）。例如正讀：5′GGTACC3′，反讀：3′CCATGG5′。
1） 迴文序列 ： 限制酶識別的序列大多數為迴文序列， 切割位點在DNA2條鏈相對稱的位置。回文對稱結構的序列經限制酶切割後， 產生的末端為匹配黏性末端， 這樣形成的 2 個末端是相同的，也是互補的，如圖 4 所示。
在回文對稱軸上同時切割 DNA 的 2 條鏈，可能產生平末端，產生平末端的 DNA 可任意連接，但連接效率較黏性末端低，如圖 5 所示。
2） 非對稱序列有一些限制酶的識別序列是不對稱的。 當識別序列為非對稱序列時，切割 DNA產生的黏性末端是不同的，稱為非對稱突出端。如BbvCⅠ，它的識別切割位點見圖 6。
4限制酶的切點一定在識別序列內部嗎？
限制酶對 DNA 的切割位點大多數在識別序列內部，但也有在識別序列外部的，如圖 7 所示
51種限制酶一定只能識別1種核苷酸序列嗎？
多數的限制酶只能識別 1 種特定的核苷酸序列，但也有例外,如前面所講的同功多位酶，能夠識別多種核苷酸序列，如圖 8 所示。
在浙科版「現代生物科技專題」第 5 頁中提到獲取目的基因通常有 2 種方法，序列已知可以用化學方法合成或者用 PCR 擴增目的基因，序列未知可以從基因文庫中獲取目的基因。但在實際題目中往往是讓學生選擇用哪種限制酶去獲取目的基因，容易使學生形成「目的基因的獲得一定用到限制酶」這樣的錯誤認知。在構建某種生物的基因文庫時常用到限制酶，通常是將某種生物材料的遺傳物質 DNA 用限制酶切成片段，插入到載體分子中，並將重組載體轉入宿主細胞，然後再用某種探針選擇、釣取目的基因。 但是用化學合成法或PCR擴增目的基因過程中不一定用到限制酶，可見，目的基因的獲得不一定需要限制酶。
在浙科版「現代生物科技專題」第 6 頁中提到獲得目的基因後，要將其與載體 DNA 連接在一起，通常是用相同的限制酶分別切割目的基因和載體 DNA，然後用 DNA 連接酶將目的基因和載體 DNA 連接在一起，形成重組 DNA 分子。從「通常」2 個字可知構建重組 DNA 時不一定用到限制酶，例如，利用 PCR 技術獲取目的基因時，通常是用耐熱性 DNA 聚合酶（如 Taq DNA 聚合酶等）擴增目的基因序列。 Taq DNA 聚合酶等擴增得到PCR 產物的 3′端附有 1 個「A」鹼基，可以在 DNA連接酶的作用下連接到 PCR 產物克隆專用載體（也稱為通用載體），如 pMD18 -T 載體。在pMD18-T 載體等通用載體插入位點2側的 3′端添加了一個「T」鹼基，這樣恰好可以與 PCR 產物末端的「A」鹼基配對，得到含有目的基因序列的重組 DNA 分子。這種重組 DNA 分子可以很方便地轉化到感受態細胞中，進行 DNA 測序以及後續的相關實驗，如圖 9 所示。
構建重組 DNA 時，通常是用相同的限制酶分別切割目的基因和載體DNA，這樣會在目的基因和載體的兩端形成相同的黏性末端，然後用 DNA連接酶將目的基因和載體連接在一起，形成重組DNA分子。但是這種情況下的兩兩連接產物除了重組 DNA 分子，還有目的基因-目的基因連接產物、載體-載體連接產物。為了防止目的基因和載體在酶切後產生的末端發生任意連接，酶切時常會選擇不同的限制酶。
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