1）為啥切不斷？
2）為啥切不乾淨？
3）為啥切錯了？
第一個問題：首先要確定的是你進行酶切的底物是啥，如果是質粒的話，主要原因可能是因為質粒上的這個酶切位點有鹼基被修飾了。甲基化等修飾都會導致無法切斷的，這時候就別用DH5α了，換用JM109。還有比較常見的是用錯Buffer，NEB的Buffer有四種，要確定雙酶切的話用什麼樣的buffer才是最合適。
但如果是PCR產物去酶切呢，就要注意了，PCR產物由於片段比較短，所以需要加上保護鹼基才能進行酶切。原理很簡單，內切酶太胖了，短了站不上去。
第二個問題有幾種可能性：
第1，酶切後粘性末端退火了，又結合在一起了；
第2，用錯了Buffer，導致或者體系中該加BSA的沒加，或者反應時間不夠；
第3，就是酶活性下降。這些其實都比較好解決，如果酶切後又退火，就直接高溫終止反反應，就解鏈了。用錯體系，及時糾正就OK了。活性下降的原因就是，你加酶的時候沒放冰盒上，或者往了關冰箱，或者就是過期了……換掉就好……
第三個問題稍微有點複雜，啥是星活性，說白了，就是內切酶該切的地方沒切，不該切的地方瞎切的一種活性。多種因素可引發星型反應：比如，1）非最適的pH；
2）Co2+、Mn2+取代Mg2+；
3）酶濃度大於25u/ug；
4）鹽濃度降低；
5）高濃度甘油的存在(>12%)；
6）有機溶劑的存在等等等等……這種時候，降低酶的用量可以緩解星活性的產生。