單鏈DNA介導的人工限制性內切酶PfAgo或可用於捕獲基因簇

2020-12-05 中國生物技術信息網

單鏈DNA介導的人工限制性內切酶PfAgo或可用於捕獲基因簇

來源： 生物催化劑設計與改造服務   發布者：左麗媛   日期：2017-02-21   今日/總瀏覽：2/3285

限制性內切酶是一識別DNA序列並在識別序列或識別序列附近進行切割的細菌蛋白。大多數限制性內切酶如II型限制酶，只能識別較短的DNA序列（如4-8bp），這大大限制了這種酶在DNA重組技術中的應用。為了克解決以上難題，已有相關蛋白質工程研究工作被報導，如通過將DNA結合域與核酸酶域（鋅指頭結合蛋白ZFNs或類轉錄激活子核酸酶TALENs）融合而成的人工限制性內切酶(Artificial restriction enzymes, AREs)；或在體外利用CRISPR-Cas9系統設計的AREs。這些已報導的AREs具有比天然存在的限制酶更高的特異性，但它們切割DNA之後並不能生成明確的黏性末端或平末端，並且這類AREs的活力不高。基於這些因素，限制了已報到的AREs在體外的應用。

Argonaute是一類可結合在短的核苷酸序列上的蛋白，它在所有生物中都很保守。在真核生物中，Argonaute蛋白參與了RNA沉默或者RNA嚮導的RNA切割；而在原核中，Argonaute蛋白可以在短的DNA序列的引導下切割ssDNA或ssRNA。而近期，來自伊利諾伊大學的研究人員，藉助來自古細菌Pyrococcus f uriosus裡的Argonaute（PfAgo），以5』端磷酸化的ssDNA為嚮導，實現了分子克隆和DNA fingerprinting。據研究人員介紹，PfAgo能夠切割靶定DNA序列形成明確的黏性末端，在切割過程中，先將PfAgo、ssDNA及線性雙鏈DNA孵育在87-98 °C高溫環境下，PfAgo在ssDNA引導下結合和切割退火後的單鏈模板；然後再將孵育溫度降低，讓切割後的DNA退火形成具有明確黏性末端的雙鏈DNA。小編認為，pfAgo介導的體外切割，從操作上來講，嚮導RNA為單鏈DNA，可直接合成，相比於Cas9系統的嚮導RNA，ssDNA的獲得更為方便且穩定；另外，PfAgo介導的切割或可用於大片段的捕獲，將基因組與pfAgo、ssDNA混合，然後根據文章所所報導的步驟進行定點切割，進而撈取我們所想要的大片段。




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