①長18～50nt，較長探針雜交時間較長，合成量低；較短探針特異性會差些。
②鹼基成分：G+C含量為40%～60%，超出此範圍則會增加非特異雜交。
③探針分子內不應存在互補區，否則會出現抑制探針雜交的「髮夾」狀結構。
④避免單一鹼基的重複出現（不能多於4個），如-CCCCC-。
⑤一旦選定某一序更符合上述標準，最好將序列與核酸庫中核酸序列比較，探針序列應與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區域的同源性不能超過70%或有連續8個或更多的鹼基的同源，否則，該探針不能用。
按上述原則選出的探針會增加成功的機會，選定後進行合成與標記，並摸索合適的雜交條件。方法是製備幾張點有特異靶DNA和不相關DNA的膜，各膜分別在不同溫度下與探針雜交，特異靶DNA雜交信號強而非特異DNA不產生任何雜交反應的就是最適雜交溫度。在進行點突變檢測雜交的反應時，洗膜條件和溫度物選擇往往更為重要。所選漂洗條件必需使野生型靶DNA與探針產生強的雜交信號而突變型靶DNA則不產生雜交信號，這可以通過逐漸提高洗膜溫度來完成。
寡核苷酸探針還有一個重要用途。在用於檢測單個鹼基差異時尚可採用一種稱為寡核苷酸限制（oligonucleotide restriction）的技術。該技術只有在突變點位於某一限制性內切酶識別位點時才有效。例如，鐮刀狀紅細胞貧血是因β珠蛋白基因的第6個寡碼子由GAG變成GTG，從而導致所編碼胺基酸由酪氨酸變成纈氨酸。突變的β-珠蛋白功能異常，稱作S珠蛋白，而野生型稱為A珠蛋白，其基因型分別為βS和βA。恰好突變點A→T位於Del I的識別序列CT－NAG之內，這就為設計寡核苷酸限制實驗創造了條件。方法是合成一個長40個鹼基的寡核苷酸探針，其5』末端距突變鹼基有11個鹼基，該探針與βA基因的非編碼鏈互補。將此探針的5』末端標記上32P。雜交方法採用液相雜交法，即在液相中將靶DNA變性解鏈，然後與探針退火，產生雜交體。如靶DNA為βA型，則兩條鏈完全互補，並產生Dde I的酶切位點；如待檢DNA為βS型，則所形成的雜交體中兩條鏈在突變鹼基處不配對，從而不能被Del I所識別。用Del I消化雜交DNA，顯然βA會被切開而βS不被切開。βADNA雜交體被切開後，5』端探針序列因只有8個鹼基，與雜交鏈結合不緊而解離，從而產生游離的5』端標記8核苷酸單鏈。不被切開的βS雜交體尚可被另一個限制酶Hinf I消化，該酶的識別位點緊靠Del I 識別位點上遊。βS雜交DNA經Hinf I消化後，將釋出探針DNA的5』末端3核苷酸小片段。βADNA雜交體因已無Hinf I識別序列，故而不能被Hinf I消化。這樣βA和βSDNA經此寡核苷酸探針雜交和Del I及Hinf I消化後，分別產生游離的8核苷酸（8nt）和3核苷酸（3nt） 片段，它們可以經電泳分離後進行放射自顯影而獲證實。藉此策略，可輕易將各種β珠蛋白突變型鑑別開，如純合野生型AA結果為僅有8nt片段，純合突變型SS則僅可檢出3nt片段，而雜合子AS型則兩種片段均存在。