《基因工程》複習資料

一.緒論

1.基因的定義：基因是一段能產生功能性肽鏈或RNA的核苷酸序列,是遺傳物質最小的功能單位。

2.基因表達的時間特異性：某一特定基因的表達嚴格按特定的時間順序發生，這就是基因表達的時間特異性。

3.基因表達的空間特異性：在個體生長全過程，某種基因產物在個體按不同組織空間順序出現。

4.管家基因：某些基因產物對生命全過程都是必需的或必不可少的，這類基因在一個生物個體的幾乎所有細胞中持續表達。

5.誘導與阻遏:

（1）在特定環境信號刺激下，相應的基因被激活，基因表達產物增加，這種基因是可誘導的。可誘導基因在特定環境中表達增強的過程稱為誘導。

（2）基因對環境信號應答時被抑制，這種基因是可阻遏的。可阻遏基因表達產物水平降低的過程稱為阻遏。

6.基因工程的定義：通過基因操作來定向改變或修飾生物體或人類自身，並具有明確應用目的的活動。

7.基因工程的基本過程：分、切、連、轉、選、鑑

8.基因工程的應用：

（1）生產基因工程藥品

（2）用於基因診斷與基因治療

（3）器官移植

（4）培育高產優質或具有特殊用途的動植物新品種

（5）用於環境監測和淨化

DNA

二.基因工程工具酶

1.基因工程中的工具酶主要是指用於DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、修飾、反轉錄等有關的各種酶系統。

2.限制作用：指一定類型的細菌可以通過限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導致噬菌體的寄主幅度受到限制。

3.修飾作用：指寄主通過甲基化酶的作用，使DNA甲基化得以修飾，從而免遭限制酶的破壞。

4.限制性核酸內切酶（RE）：是識別DNA的特異序列，並在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。

5.限制性內切酶的種類分為一型，二型，三型，二型，最常用。

6.二型限制性內切酶的特點：

（1）二型限制與修飾系統所佔的比例最大

（2）二型限制酶一般是同源二聚體，由兩個彼此相按相反方向結合在一起的相同亞單位組成，每個亞單位作用在DNA鏈的兩個互補位點上。

（3）是單一亞基只具有識別切割作用，修飾作用有其他酶進行。

（4）識別回文對稱序列，在迴文序列內部或附近切割DNA須Mg+的存在，才能發揮活性。

（5）識別靶標序列長4～7bp.切割位點距離識別位點20bp內

7.一型限制性內切酶（三亞基雙功能酶）：

（1）種類很少，只佔1%

（2）其限制酶和甲基化酶各作為一個亞基存在於酶分子中，另外還有負責識別DNA序列的s亞基

（3）同時具有修飾和識別切割的作用，輔助因子ATP，鎂離子，s腺苷甲硫氨酸。

（4）切割位點在識別位點1000 bp以外，且無特異性。

8.三型限制性內切酶（2亞基雙功能酶）：

（1）種類很少，所佔比例不到1%

（2）限制酶和甲基化酶各作為一個亞基存在於酶分子中，同時具有修飾及識別切割的作用，需輔助因子ATP，Mg+，s腺苷甲硫氨酸。

（3）切割位點在識別位點下遊24～26bp處

9.限制酶所識別的序列的特點是：呈現鹼基互補對稱，無論是6個鹼基還是4個鹼基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側的雙鏈DNA上的鹼基是反向對稱重複排列的，稱為迴文序列。

10.限制酶的酶切切口：黏性末端、平末端

11.黏性末端：被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。

12.平末端：當限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口是平整的。

13.同裂酶（同切點酶）：又稱異源同工酶，指來源不同，但具有相同的識別序列，切割位點可以相同也可以不同。

14.同尾酶：能切割產生相同末端的限制性內切酶，一般是指能產生相同黏性末端的限制性內切酶。這兩個相同的黏性末端稱為配伍末端。

15.DNA末端長度對限制酶切割的影響：識別序列兩端必須有一定數量的核苷酸

16.位點偏愛：某些限制酶對同一介質中的某些位點表現出偏愛性切割，即對不同位置的同一個識別序列表現出不同的切割效率的現象。

17.星星活性：在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星星活性。

18.引起星星活性的因素：甘油濃度過高，酶過量，離子強度低，Ph過高，有機溶劑，其他陽離子代替了Mg+

19.酶切反應條件：

（1）緩衝液：提供穩定的ph值和緩衝劑，Mg+，DTT（二硫蘇糖醇），BSA(小牛血清蛋白)

（2）反應溫度大多為37℃

20.終止酶切的方法：EDTA，加熱，苯酚抽取去除蛋白

21.RFLP：限制性片段長度多態性技術的原理是檢測DNA在限制性內切酶酶切後形成的特定的DNA片段的大小。

22.DNA聚合酶：又稱DNA依賴的DNA聚合酶，它是以親代DNA為模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一類酶。

23.DNA聚合酶1：（1）5'→3'DNA聚合酶活性（2）5'→3'核酸外切酶活性（3）3'→5'核酸外切酶活性（校正作用）

24.Klenow片段：DNA聚合酶1用枯草芽孢桿菌蛋白酶處理後，該酶被降解成兩個片段，較大的片段包括326~928殘基，稱為Klenow片段。具有5＇→3＇聚合酶活性和3＇→5＇外切酶活性。

25.TaqDNA聚合酶：是一種耐熱的依賴DNA的DNA聚合酶，催化DNA合成的最適溫度為70~75℃。具有5＇→3＇聚合酶活性和5＇→3＇外切酶活性但沒有3＇→5＇外切酶活性，因而無3＇→5＇方向的校正功能。

26.T4DNA聚合酶：是一種攜帶有高表達噬菌體的大腸桿菌中提純製備而來的。

具有5＇→3＇聚合酶活性和3＇→5＇外切酶活性（該活性比DNA聚合酶一強）

27.T7DNA聚合酶：從t7噬菌體感染大腸桿菌細胞中純化出來的，有兩個亞基組成。T7噬菌體基因5編碼的大亞基.大腸桿菌編碼的小亞基，硫氧還蛋白，增加大亞其對模板的親和性。

28.逆轉錄酶：是一種依賴RNA的DNA聚合酶，即以rna為模板合成DNA，合成方向為5＇→3＇延伸，無3＇→5＇外切酶活性。

29.逆轉錄酶具有以下3種活性：

（1）以單鏈rna為模板催化合成cDNA單鏈

（2）具有RNase H活性，能水解RNA:DNA雜交鏈中的RNA

（3）以DNA為模板，催化合成cDNA雙鏈

30.DNA連接酶:能催化合成雙鏈DNA片段靠在一起的3＇羥基末端與5＇端磷酸基團末端之間通過形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接的一種核酸酶。

31.大腸桿菌DNA連接酶，依賴NAD＋供能

T4DNA連接酶依賴ATP供能（廣泛使用）

32.鹼性磷酸酶：用於脫去DNA5＇末端的磷酸根，使5＇—p成為5＇—oH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。

33.多聚核苷酸激酶：催化多聚核苷酸5＇羥基末端磷酸化，用於標記探針。

34.末端轉移酶：將標記或未標記的dNTP加到3＇—OH末端，也可催化載體分子或待克隆的DNA片段上加上互補的同聚尾，便於進一步連接。

35.S1核酸酶：只水解單鏈DNA或RNA，用於將黏性末端水解成平末端及cDNA髮夾式結構的處理。

36.核糖核酸酶H：催化DNA:RNA雜合鏈中RNA部分的內切降解作用。

三.載體

1.基因載體是一類能自我複製的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其複製，可用以置換或插入外源（目的）DNA而將目的DNA代入宿主細胞。

2.理想的載體應具備的條件：

1) 能夠在宿主細胞中存在並繁殖，有功能良好的複製止和啟動子使插入基因複製和表達

2) 具有多個限制性內切酶的切點，且切點是單一的，這樣可將多個多源DNA片段插入其中。

3) 具有容易檢測的篩選標記

4) 載體DNA的分子量適當，可容納較大的外源DNA片段，又可在受體細胞內擴增較多的拷貝

5) 在細胞內穩定性高，這樣可以使重組體可以穩定傳代而不易丟失

3.質粒：是獨立於染色體外，具有自主複製能力的遺傳單位，其本質是較少的核酸分子大小在1kb~200kb以上不等。

4.質粒的生物學特性：

1) 質粒的自主複製性

2) 質粒的不相容性：是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關係密切的不同質粒，不能夠在同一寄主細胞系中穩定地共存的現象。

3) 質粒的可轉移性：在自然條件下，很多質粒可通過稱為細菌接合的作用，轉移到新的宿主細胞內

4) 攜帶特殊的遺傳標記

5.質粒載體的構建：

1) 加入合適的選擇標記基因，通常是抗生素基因

2) 增加或減少合適的酶切位點，便於重組

3) 縮短長度，切去不必要的片段，增加裝載量

4) 改變複製子，由嚴緊變為鬆弛型，以增加拷貝數

5) 加裝特殊的基因元件

6.插入失活：一個基因位點中插入外源DNA片段，從而使該基因活性喪失的現象。

7.α互補：質粒還有一個來自大腸桿菌的經過加工LacZ＇的基因，它編碼β半乳糖苷酶胺基酸146個胺基酸，可以和β半乳糖苷酶的缺陷型的大腸桿菌實現基因內互補，恢復分解乳糖的能力。

8.藍白篩選：X—gal是β半乳糖苷酶的一種底物，經降解後可生成溴氯吲哚，使大腸桿菌菌落呈藍色。當外源基因插入到PUC質粒的LacZ＇基因內部，則LacZ＇基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的β半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。反之，非重組體為藍色菌落。（在培養基中加amp，X—gal.IPTG進一步篩選）

9.T載體：Taq聚合酶具有末端轉移酶的活性，可在DNA片段的3＇末端添加一個核苷酸，通常為A，根據這一特點研製出線性T載體，其5＇各帶有一個不配對的T，從而進行黏端互補連接，達到高效克隆的目的。

10.穿梭質粒載體：是由人工構建的具有兩種不同複製起點和選擇記號，因而可在兩種不同的寄主細胞中存活和複製的質粒載體。

11.科斯質粒載體（cosmid載體）：也稱粘粒。這是一類用於克隆大片段DNA的載體，它是由λ噬菌體的cos末端及質粒載體重組而成的載體。

12.cos位點：λ噬菌體顆粒中的DNA為線狀雙鏈DNA分子，全長48502bp，兩端各有一段長度為12個核苷酸的互補單鏈（粘端）

13.噬菌體載體的構建：

（1）去除非必須區，建立外源DNA片段的克隆或替換點

（2）在λ噬菌體的非必須區內插入選擇標記基因：CI基因失活，Spi篩選，Lacz藍白斑篩選

（3）建立重組的λDNA分子的體外包裝系統

14.CI基因的表達促進λ噬菌體進入溶源狀態，基因CI產物活性受到影響會促進λ噬菌體進入裂解循環。CI基因失活後導致噬菌體不能溶原化，產生清晰的噬菌斑。

15.Spi篩選：野生型λ噬菌體不能在P2噬菌體溶源性細胞內生長，這是受λ噬菌體red和gam產物控制的。因此，red和gam被外源DNA取代後，獲得的spi—表型，能夠在P2噬菌體溶源性細胞內生長。

16.M13噬菌體：閉合環狀單鏈ssdna，可以直接轉染宿主，但缺少選擇標記和克隆位點

17.酵母人工染色體載體（YAC）：把酵母染色體與基因複製和表達有關的主要組件都組裝質粒上，令質粒行使酵母的轉錄功能和複製功能。

18.表達載體：在克隆載體基本骨架的基礎上增加表達元件，如啟動子、核糖體結合位點、終止子等，使目的基因能夠表達的載體。

19.表達載體必須具備的條件

1) 載體能夠獨立的複製

2) 具有靈活的克隆為位點和方便的篩選標記

3) 具有很強的啟動子

4) 具有阻遏子

5) 具有很強的終止子

6) 有翻譯的起始信號

20.外源基因在原核細胞中表達的表達元件：

1) 啟動子：是RNA聚合酶識別結合和開始轉錄的一段DNA序列

2) SD序列（核糖體結合位點）：它是由起始密碼上AUG和一段位於AUG上遊3~10bp處的3~9bp的序列組成。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16sRNA3＇末端的富含嘧啶的序列互補，mRNA於是與核糖體很好結合。

3) 增強子

4) 轉錄終止子

5) 翻譯起始密碼子

6) 翻譯終止密碼子

21.外源基因在原核細胞中的表達方式：

1) 組成型表達：T7噬菌體啟動子等屬於組成型啟動子，在該類啟動子的驅動下，外源基因源源不斷地表達，產量高，但不適合有毒蛋白的表達

2) 誘導型表達：Lac啟動子，IPL啟動子，等，可控制表達，適合大多蛋白，特別是有毒蛋白的表達。

3) 融合型表達：表達載體的多克隆位點上有一段融合表達標籤（tag），表達為融合蛋白，可方便後續的蛋白分離純化或檢測。His—Tag最廣泛。

4) 分泌型表達：在起始密碼和目的基因之間加入一個信號肽，可以引導目的蛋白穿越細胞膜，可避免表達產物在細胞內過度積累，而影響細胞的生長。

22.酵母質粒表達載體：一般構件為穿梭載體，即可在大腸桿菌中，又可以在酵母細胞中進行複製和擴增。

23.Ti質粒：是在根瘤土壤桿菌細胞中存在的一種染色質之外，自主複製的環形雙鏈DNA分子。

24.Ti質粒表達載體構建：一元載體和雙元載體

25.一元載體：含目的基因的中間表達載體與改造後的受體（Ti質粒）通過同源重組所產生的一種複合型載體。

26.雙元載體：是指兩個分別含有T—DNA和Vir區的相容性突變Ti質粒構成的系統，其中之含有T—DNA轉移所必須的Vir區段，它缺失或部分缺失T—DNA序列，其主要功能是表達毒蛋白激活T—DNA轉移，也稱輔助Ti質粒。另一個則是含有T—DNA的微型質粒，它帶有目的基因和大腸桿菌及農桿菌複製起始點。

27.病毒表達載體：是以病毒基因組序列為基礎，插入必要的表達元件所構建成的真核基因轉移工具。

28.病毒表達載體的應用：

1) 外源蛋白的真核表達：杆狀病毒表達載體、痘病毒表達載體

2) 基因治療：反轉錄病毒載體、腺病毒表達載體

3) 多價、多聯活載體疫苗的研製：痘病毒

4) 基因功能鑑定：反轉錄病毒載體

29. RNA幹擾：雙鏈RNA對基因表達的阻斷作用，是真核生物中普遍存在的轉錄後基因沉默機制。

30.多克隆位點（MCS）：指DNA載體序列上人工合成的一段序列，含有多個限制性內切酶識別位點，能為外源DNA提供多種可插入的位置或插入方案。

四.基因操作中大分子的分離與分析

1.核酸凝膠電泳的基本原理：

核酸分子中磷酸基團一般呈離子化狀態，DNA和RNA的多核苷酸鏈實際上是多聚陰離子，它們在電場中可向著正電極方向遷移。在一定的電場強度下，DNA或rna分子的遷移速度取決於核酸分子大小和構型。

2.影響DNA在凝膠中遷移速率的因素：

DNA分子大小、構象、凝膠濃度、電壓、緩衝液

3.瓊脂糖凝膠電泳：用於分離大於200~1000bp的片段，操作簡單，快速且分離範圍廣，解析度高。

4.聚丙烯醯氨凝膠電泳：適用於小分子DNA（5~500bp）的片段，寡聚核苷酸和蛋白質的分離，可分離相差一個核苷酸的不同DNA片段，是DNA序列分析的關鍵技術之一。

5.脈衝電場凝膠電泳：這種電泳是在兩個不同方向的電場周期性交替進行的。DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應所需的時間取決於它的大小。主要用於大於40kb的DNA和染色體的分離。

6.分子雜交：是標記的探針DNA變性後與變性後的靶DNA通過鹼基互補配對結合，形成雜種分子的過程。

7.探針：一段帶有檢測標記的與目的基因或目的DNA特異互補的已知核苷酸序列。

8.探針的標記方法：缺口平移法、隨機引物標記法、末端標記法

9.Southern blot：DNA—DNA雜交

10.Northern 雜交：DNA與RNA，應用特異性基因探針分析基因的轉錄水平

11.Western Blot：是蛋白水平檢測，研究基因表達與功能的一種方法。

五.PCR技術（聚合酶鏈式反應）

1.PCR的原理：

類似於DNA的天然複製過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性退火延伸三個基本步驟構成，在taqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留複製鏈，新鏈又可成為下次循環的模板，重複循環變性退火延伸三個過程，就能把目的基因擴增放大。

2.PCR的反應體系：

1) 4種dNTP混合物：各200umol╱l

2) 引物：各10~100pmol

3) 模板DNA：0.1~0.2ug

4) TaqDNA聚合酶：2.5ug

5) Mg+：1.5mmol╱l

3.引物設計要求：

1) 序列應位於高度保守區，與非擴增區無同源序列

2) 引物長度以15~40bp為宜

3) 鹼基儘可能隨機分布，G+C佔50~60%

4) 引物內部避免形成二級結構

5) 引物間避免有互補序列

6) 引物3＇端為關鍵鹼基，5＇端無嚴格限制

4.PCR的基本過程：

1) 變性：使雙鏈DNA解鏈為單鏈，95℃，20~30秒

2) 退火：37~72℃，使引物與模板的互補區結合。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結合，降低溫度可增加反應的靈敏性

3) 延伸：70~75℃，延伸時間由擴增片段長度決定

5.PCR循環次數主要取決於模板DNA濃度一般為25到35次。

6.不對稱PCR：兩條引物比例相差較大的PCR，可用於擴增產生特異長度的單鏈DNA

7.反向PCR：是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段，對某個已知DNA片段兩側的未知序列進行擴增。

8.多重PCR：它是在同一反應體系中，用多對引物同時擴增幾種基因片段的方法，主要用於同一病原體分型及同時檢測多種病原體。

9.LP—PCR：利用同位素，螢光素等對pcr引物進行標記，用以直觀的檢測目的。

10.錨式PCR：是在基因未知序列端添加同聚物尾，再用根據同聚物尾設計引物和已知序列的特異性引物進行pcr擴增，獲得的PCR產物中包含了未知序列。

11. RT—PCR：先在反轉錄酶的作用下以mRNA為模板合成cDNA一條鏈，再以cDNA第一鏈為模板，加入dNTP和兩個特異性引物進行pcr，擴增出特異mRNA相應的cDNA。

12.原位PCR：是指直接用細胞塗片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行pcr擴增，然後用特異探針進行原位雜交檢測目標序列的細胞的一種方法。

13.鏈終止法測序：通過合成與單鏈DNA互補的多核苷酸鏈，由於合成的互補鏈可在不同位置隨機終止，反應產生只差一個核苷酸的DNA分子，從而來讀取待測DNA分子的順序。

六.克隆

1.DNA克隆：為獲得所需的基因或特異序列，需從細胞中分離得到目的基因與載體DNA重組，並用適當方法在宿主細胞中擴增，得到大量相同的DNA片段，稱為DNA克隆。

2.DNA克隆技術可歸納為：分、切、接、轉、篩

3.目的基因的獲取方法：

1) 化學合成法（要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的胺基酸序列）

2) 基因組DNA文庫

3) cDNA文庫

4) PCR

4.基因組DNA文庫：存在於轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。

5.cDNA的定義：是指互補DNA，特異指在體外經過逆轉錄後與RNA互補的DNA鏈

6.cDNA文庫：是指某生物某發育時期所轉錄的全部mRNA經反轉錄形成的cDNA片段，與某種載體連接而形成的克隆的集合。

7.外源基因與載體的連接：

1) 粘性末端連接：同一限制酶切位點連接，不同限制酶切位點連接

2) 平端連接：平末端的直接連接、同聚物加尾連接（在末端轉移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，製造出粘性末端，再連接）、人工接頭連接（人工接頭是指用化學方法合成的一段由10~12個核苷酸組成，具有一個或數個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段，由平端加上人工接頭，在用限制酶酶切產生黏性末端，再進行粘端連接）、DNA銜接物連接法（也是人工合成的一段雙鏈寡核苷酸鏈，與人工接頭不同的是一頭為平末端，另一頭帶有某種限制內切酶的粘性末端）

8.重組DNA導入受體菌的方法：

1) Cacl2法：細菌在低溫和低滲環境，通透性增加，膨脹成球形，吃時轉化混合物中的DNA形成羥基鈣磷酸混合物黏附於細胞表面，經短暫熱休克，促進細胞吸收重組子

2) 電穿孔法

3) 轉染試劑法：陽離子型脂質體

4) 顯微注射法

5) 基因槍

9.感受態：受體細胞經過一些理化或生物學方法處理後，能夠從周圍環境中攝取DNA分子，這種特殊生理狀態

10.轉化（基因工程概念）：是指以質粒為載體，將外源DNA導入處於感受態的大腸桿菌等原核宿主細胞，並使其獲得新的變型的過程。

11.轉導：由噬菌體和病毒載體的DNA重組分子包裝成病毒顆粒，通過感染的方式將遺傳信息傳遞給另一細胞的過程。

12.轉染：是真核細胞在一定條件下主動或被動導入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。

13.轉化率（cfu╱ugDNA）：每微克重組DNA轉化後，接納DNA分子的受體細胞的個數，即陽性克隆數。

14.重組體的篩選與鑑定：

重組子：是指含有重組DNA分子的轉化細胞

（1）載體表型選擇

（2）插入基因選擇法：DNA水平鑑定（特異pcr，以外源基因兩側序列設計引物，酶切鑑定）、轉錄水平鑑定、翻譯水平鑑定

七.表達

1.基因表達：是指外源基因克隆到某種表達系統的載體中，再引入合適的宿主細胞中合成功能性基因產物的過程。

2.包涵體：重組蛋白在胞內表達時，常常以不溶性蛋白聚集成的晶狀物形式存在，這種晶狀體即包涵體。

八.補充：

1.限制性核酸內切酶的活性受哪些因素影響

⑴酶的純度

⑵DNA樣品的純度.

⑶DNA的甲基化程度.

⑷酶切反應的溫度與時間

⑸DNA分子的構型.

⑹限制性核酸內切酶的反應緩衝液.

2.大腸桿菌作為基因工程受體菌具有哪些特點？真核基因在大腸桿菌中表達存在哪些障礙？

（1）特點：大腸桿菌培養方便、操作簡單、成本低廉，基礎生物學、分子遺傳學等方面的背景知識清楚，對其基因表達調控的分子機理也比較了解，而且歷經二十年的基因工程實踐，大腸桿菌已發展成為一種安全的基因工程實驗體系，有多種適用的寄主菌株和載體系列，大腸桿菌易於進行工業化批量生產。

（2）存在的障礙：

第一，在大腸桿菌的mRNA的核糖體結合位點上，含有一個起始密碼子及16S核糖體RNA 3′末端鹼基互補序列，即S-D序列，而真核上缺泛這個序列。

第二，許多真核基因的蛋白質產物需要經過翻譯後的加工修飾，如正確的摺疊和組裝，而細菌中通常並沒有這樣的修飾機制，從而可能導致真核基因在大腸桿菌中的翻譯產物無法產生有活性的蛋白。

第三、外源真核基因所表達的蛋白質分子往往能夠被細菌的蛋白酶識別，並被當做「異已分子」降解掉。

3.如何有效地提高外源基因的表達效率？

⑴提高啟動子強度

⑵縮短啟動子同克隆基因間距離

⑶高效的翻譯起始序列

⑷高效的轉錄終止區

⑸提高質粒拷貝數及穩定性

⑹用以下方法提高翻譯水平：

①調整SD序列與AUG間的距離

②用點突變的方法改變某些鹼基

③增加mRNA的穩定性的

⑺減輕細胞的代謝負荷：

①誘導表達

②表達載體的誘導複製

⑻提高表達蛋白的穩定性，防止其降解：

①克隆一段原核序列，表達融合蛋白

②採用某種突變菌株

③表達分泌蛋白質

4.PCR技術主要應用在哪些領域？

①核酸基礎研究

②序列分析

③檢測基因表達

④從cDNA文庫中放大特定序列

⑤研究已知片段鄰近基因或未知DNA片段

⑥進化分析

⑦醫學應用

⑧分析生物學證據

⑨性別控制

⑩轉基因檢測