...開創性地開發出一種新的基因編輯方法---基於PfAgo的人工限制酶
2021-01-10 生物谷圖片來自ACS Synthetic Biology, doi:10.1021/acssynbio.6b00324
2017年2月17日/
生物谷BIOON/---在一項新的研究中，美國伊利諾伊大學香檳分校化學與生物分子工程系教授Huimin Zhao和研究生Behnam Enghiad開創性地開發出一種新的基因工程方法用於基礎生物學研究、應用生物學研究和醫學應用。他們的研究有潛力通過改善DNA切割的精確度和忠誠度為基因組研究打開新的大門。相關研究結果於2017年2月6日在線發表在
ACS Synthetic Biology期刊上，論文標題為「Programmable DNA-Guided Artificial Restriction Enzymes」。
Zhao說，「利用我們的技術，我們能夠構建出高度活性的人工限制酶（artificial restriction enzymes, AREs），這些AREs幾乎對任何一種序列產生特異性，而且能夠產生確定的長度可變的粘性末端。這是生物技術領域的一個罕見的例子，在這個領域裡，人們能夠以一種理性的方式輕鬆地和準確地設計一種想要的生物學功能或試劑。」
限制酶是基因組研究的一種重要的工具：通過在特定的位點切割DNA，它們產生切口，供外來DNA插入，從而實現基因編輯的目的。這個過程不僅是通過自然發生的限制酶實現的，而且其他的AREs近幾年來日益吸引人們的關注。用於「剪切-粘貼」基因編輯的
細菌免疫系統CRISPR-Cas9和修飾的限制酶TALEN是這類技術的兩個流行的例子。
儘管在基因工程中有用處，但是沒有AREs會產生確定的「粘性末端」。粘性末端指的是DNA梯形結構在限制酶的作用下會產生不平齊的切口，留下幾個突出的核苷酸，它們之間正好互補配對。當插入新的DNA時，粘性末端會提高插入成功率。Enghiad解釋道，「如果你能夠利用相同的限制酶切割兩種不同的DNA樣品，那麼產生的粘性末端是互補的。它們彼此之間發生雜交。如果你使用一種連接酶，那麼你能夠將它們連接在一起。」
然而，限制酶本身有一種重大的缺點：促使它們進行切割的識別序列是非常短的---通常僅為四到八個鹼基對。鑑於這些酶會在這種識別序列出現的任何地方進行切割，因此科學家依賴於發現切割位點在有機體的基因組或質粒中僅出現一次的限制酶。當手邊的DNA長几千個鹼基對時，這經常是一個難題。
這個問題可部分上通過發現的限制酶的絕對數量加以解決：已描述了3600多種限制酶，但僅有250多種限制酶是市場上可買到的。Enghiad說，「在我們的冰箱裡，為了我們的其他研究，我們很可能有100多種不同的限制酶。每當我們想要組裝東西時，我們仔細查看它們，但是發現獨特的限制位點的機率是非常低的。」
「我們的新技術將所有的這些限制酶統一到由一種蛋白和兩種嚮導DNA組成的單個系統中。你不僅能夠替換它們，而且你如今也能夠靶向其他的限制酶不能夠靶向的限制位點。」
Enghiad和Zhao開發的這種技術是通過使用一種從強烈熾熱球菌（
Pyrococcus furiosus）提取出的Argonaute蛋白（PfAgo）構建AREs。當PfAgo發現它的切割位點時，在一種嚮導DNA的引領下，它能夠識別更長的序列，從而增加它的切割特異性，消除了限制酶帶來的很多障礙。再者，PfAgo甚至能夠比限制酶產生更長的粘性末端，相比於其他的AREs，這是一種重大的益處。
Enghiad解釋道，「當我們開始研究時，我受到一篇針對一種相關蛋白TtAgo的論文的啟發。它能夠使用一種嚮導DNA切割DNA，但僅在高達70℃下才會進行切割。DNA鏈在75℃以上開始分離，這能夠允許一種蛋白產生粘性末端。我推斷，如果一種蛋白在更高的溫度下有活性的話，那麼這種蛋白能夠作為一種人工限制酶發揮作用。」
「因此，我開始尋找這樣的人工限制酶，結果我發現了PfAgo。」
除了替換用於基因工程的限制酶，Enghiad和Zhao認為他們的技術將在生物學研究中具有廣泛的應用。通過產生任意長的粘性末端，PfAgo能夠更加容易地組裝大分子DNA，並且能夠克隆大分子DNA。
這種技術的應用是非常廣泛的。它的應用範圍從發現新的小分子藥物到設計微生物細胞工廠用於合成燃料和化學物，再到對
遺傳病和病原體進行分子
診斷。這些都是Zhao和Enghiad當前正在研究的領域。
Zhao說，「由於它的史無前例的簡單性和可編程性（單個DNA，加上用於靶向的嚮導DNA）以及可獲得性，我們期待在所有的基於限制酶或核酸酶的生物技術應用和基礎生物學研究中，基於PfAgo的AREs將變成一種強大的必不可少的工具。它在分子生物學中的作用就好比是CRISPR技術在
細胞生物學中的作用。」（生物谷 Bioon.com）
本文系生物谷原創編譯整理，歡迎轉載！點擊 獲取授權 。更多資訊請下載生物谷app。原始出處：Behnam Enghiad, Huimin Zhao. Programmable DNA-Guided Artificial Restriction Enzymes. ACS Synthetic Biology, Publication Date (Web): February 6, 2017,doi:10.1021/acssynbio.6b00324.
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會議時間：2017.6.9 -6.10 會議地點：上海
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