論文標題：Optimizing genome editing strategy by primer-extension-mediated sequencing
期刊：Cell Discovery
作者：Jianhang Yin, Mengzhu Liu, Yang Liu, Jinchun Wu, Tingting Gan, Weiwei Zhang, Yinghui Li, Yaxuan Zhou, Jiazhi Hu
發表時間：2019/03/26
數字識別碼： 10.1038/s41421-019-0088-8
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2019年3月26日，北京大學生命科學學院和北大-清華生命科學聯合中心胡家志課題組在Cell Discovery 上發表題為Optimizing genome editing strategy by primer-extension-mediated sequencing的論文。該研究描述了一種新的方法，可以用來同時定量檢測Cas9編輯效率和脫靶活性以及編輯引起的染色體異常結構，即primer-extension-mediated sequencing（PEM-seq）。這是對基因編輯和DNA損傷修復等領域都有巨大促進作用的新技術。
CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins)是目前最常用的基因編輯工具酶，在科研領域被廣泛應用，而在臨床方面的應用因為其脫靶活性一度停滯不前。它通過guide RNA（gRNA）與靶向DNA序列的配對，從而將Cas9錨定在靶向基因並誘導產生DNA雙鏈斷裂（DSB）。在基因編輯誘發的DSB的修復過程中，一定機率會產生基因突變或者外源DNA片段的插入，從而達到基因編輯的目的。在實際應用過程中，一個好的基因編輯酶Cas9需要同時滿足高效切割靶位點、低脫靶活性和低染色體異常三個特點。目前在這三個方面，有一部分基於PCR的方法用於估算基因編輯效率，但其結果可靠性有待提高；有一些基於高通量測序的方法可以在體內或者體外檢測基因編輯酶的脫靶活性；尚無系統的可定量的測量基因組異常結構的方法。
依據DNA雙鏈斷裂與染色體易位的原理，胡家志課題組在已有的高通量測序方法(Hu et al., Nature Protocols 2016)的基礎上開發了靈敏度更高且可以全面且定量評估基因編輯的新方法 PEM-seq。與以往基於二代測序評估Cas9脫靶活性的方法相比，PEM-seq不僅可以靈敏的找出Cas9的脫靶位點，還可以精確定量CRISPR/Cas9在靶向位點的切割效率，從而找到更加高效安全的Cas9切割位點。與此同時，PEM-seq還深度揭示了靶向位點附近由於基因編輯而產生的染色體異常結構，例如大片段缺失、染色體易位等。以靶向治療RAG1基因上的RAG1A編輯位點為例，胡家志課題組發現：在Cas9切割位點5kb以內存在著佔總編輯事件2.5%的大量的染色體缺失倒位等異常結構；更為嚴重的是，這些異常結構可以延伸至距離切割位點50kb甚至更長的領域，足以嚴重威脅基因組的穩定性。這些現象揭示了Cas9應用前評估的必要性。應用PEM-seq可以全面地評估Cas9的切割效率及其所導致的大多異常結構，從而優化基因編輯策略，以達到獲得最大編輯效率且儘量減少脫靶活性的效果。
圖1: PEM-seq檢測出Cas9 在RAG1A位點有53個脫靶位點
圖2：PEM-seq檢測到在Cas9切割位點5kb內存在著大量染色體異常機構
同時，為了降低CRISPR/Cas9的脫靶活性，胡家志課題組將現有Cas9變體的突變位點進行了組合篩選，通過PEM-seq篩選出了一個切割效率與野生型Cas9相當但脫靶頻率明顯更低的變體FeCas9。該酶的使用方法與傳統Cas9類似。
此外，PEM-seq在基因組的穩定性研究方面還有較大的潛力。基因組的修復與DNA修復等因素密切相關，而傳統的方法多用PCR或者分子克隆獲得修覆信息，樣本小且存在偏好性。PEM-seq與一些之前的高通量測序方法類似，可以提供較大的數據量，且相對而言有一個更加明顯的優勢，即定量。PEM-seq可以對DNA修復的步驟進行逐步定量，從而細緻地描畫DNA從損傷到修復的過程，以獲得更加精準的模型。
摘要：Efficient and precise genome editing is essential for clinical applications and generating animal models, which requires engineered nucleases with high editing ability while low off-target activity. Here we present a high-throughput sequencing method, primer-extension-mediated sequencing (PEM-seq), to comprehensively assess both editing ability and specificity of engineered nucleases. We showed CRISPR/Cas9-generated breaks could lead to chromosomal translocations and large deletions by PEM-seq. We also found that Cas9 nickase possessed lower off-target activity while with some loss of target cleavage ability. However, high-fidelity Cas9 variants, including both eCas9 and the new FeCas9, could significantly reduce the Cas9 off-target activity with no obvious editing retardation. Moreover, we found AcrIIA4 inhibitor could greatly reduce the activities of Cas9, but off-target loci were not so effectively suppressed as the on-target sites. Therefore, PEM-seq fully evaluating engineered nucleases could help choose better genome editing strategy at given loci than other methods detecting only off-target activity.
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期刊介紹：Cell Discovery is an open access international journal that publishes results of high significance and broad interest in all areas of molecular and cell biology. Cell Discovery is established in 2015 as a sister journal of the high profile international journal Cell Research
（來源：科學網）
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