本研究報導的這項高通量篩選技術已經被用來在3D細胞培養中篩選與神經發育性疾病有關的基因，該技術揭示了一種罕見的被稱為小頭畸形症可能涉及的發病機制。與自閉症、精神分裂症和癲癇症等神經發育性障礙有關的這些基因，都可以通過該技術篩選出來。
基因成千上萬種的變異方式增加了個體受神經系統嚴重紊亂影響的風險，例如：出現大腦發育不良1-3。了解這些基因變異所產生的影響，可以揭示疾病的發病機制，同時還有助於發現可能存在的新的藥物靶點。但是單獨對每種基因變異進行研究是一個緩慢且艱難的過程。
除此之外，人類大腦的複雜性也使得此類研究的進行變得愈發困難。Esk等人4在《科學》雜誌上發表了一篇論文，文章中概述了一種被稱為高通量體外篩選的方法，此種方法有望克服上述研究阻礙。隨後，作者利用他們所描述的這種篩選技術，對一種被稱作小頭畸形症的罕見發育狀況的相關基因進行了分析。
患有小頭畸形症患者的大腦——特別是大腦的外部，即大腦皮層——比普通大腦要小得多1-3。之所以出現這樣的現象原因有二，由於神經幹細胞增殖的減少或是由於大腦發育過程中細胞死亡的增加。小頭畸形症常伴隨著一系列的基因和遺傳症候群1-3。
若要確定這些基因是否確實與小頭畸形症有關，需要用到高通量技術，但是現有的篩選方法有其局限性。舉例來講，那些使用動物來驗證效果的高通量技術研究可能是存在問題的，因為在不同的動物模型中，等效基因突變可能會產生不同的影響5，並且與神經發育障礙相關的基因在不同物種中的表達可能是不同的。2D細胞培養系統不能完全捕捉3D組織中不同類型神經元和神經膠質細胞之間的交互作用等過程，而這些過程對於正常細胞的增殖來講至關重要。
但是被稱為類器官的3D細胞培養系統，可以通過幹細胞生成類似大腦的結構，這也為克服使用動物模型和2D細胞培養所面臨的問題提供了一種強有力解決方案6。類器官會形成類似大腦的組織，可以重現人類從妊娠早期到中期皮質發育過程中關鍵細胞和基因的表達特徵6，7。
然而，以3D形式模擬複雜組織對於高通量篩選來講是一把雙刃劍。不同細胞群生長速率的可變性，使得我們難以確定細胞存活或增殖所存在的差異是由於實驗的性質還是由於類器官固有的變異性。
Esk等人試圖通過將腦類器官與一種基於基因編輯的新技術CRISPR-Cas9相結合的方法，來克服上述問題。在CRISPR-Cas9技術中，引導性RNA（gRNA）被設計成能夠與即將被編輯的DNA序列結合的形式。Cas9酶隨後與gRNA結合併使DNA鏈斷裂。通常情況下，這種DNA鏈斷裂會被細胞錯誤地修復，而修復的結果可能導致基因被「敲除」，也就是說我們感興趣的基因將不再被翻譯成功能性蛋白質。
Esk及其同事針對173個與小頭畸形症有關的基因設計了相對應的gRNA，並且使用一種稱為譜系條形碼的獨特DNA序列對每個gRNA進行了標記。隨後，他們用這些條形碼gRNAs感染了幹細胞。每個接收到給定gRNA的細胞及其所有後代攜帶的條形碼都是相同的，這方便了我們對細胞譜系進行識別。將幹細胞在3D培養基中培養40天形成一個腦類器官，隨後提取並匯集所有類器官細胞中的DNA。
篩選的目的是計算每個感興趣基因的譜系條形碼的數量，並將該數值與未發生任何基因突變的對照gRNA的譜系條形碼數量進行比較。如果與對照gRNA譜系條形碼的數量相比，候選基因的譜系條形碼發生了損耗，則表明該基因是細胞正常增殖所必需的。但是，在分析過程中我們很難檢測到數量較少的譜系條形碼（即來自小譜系的條形碼）。這就需要我們設定更高的解析度，從而確保能夠檢測到中度細胞丟失的情況（而中度細胞丟失這是小頭畸形症的典型特徵）。除此之外，正如上文所述，在一個3D腦類器官中，基線譜系大小的變化是非常大的。
為了解決這些問題，Esk等人在DNA處理過程中為每個細胞添加了第二類條形碼，從而對譜系中每個細胞的DNA分別進行了標記（圖1）。對細胞進行單個的條形碼標記，使得研究人員能夠精確地追蹤每個譜系中究竟有多少細胞。
雙重條形碼標記共同解釋了類器官細胞生長的變異性（每個基因可以使用多個gRNAs，從而可以更可靠地檢測到細胞變異的趨勢），同時對每個細胞進行條形碼標記使得我們檢測小譜系的細胞增殖變化成為可能，這也更方便我們對基因缺失導致的中度細胞丟失的情況進行識別。該研究團隊將他們所使用的這種技術命名為，異質組織中以細胞解析度進行的CRISPR譜系追蹤（CRISPR-LICHT）。
圖1 | 基因編輯和譜系追蹤方法——CRISPR-LICHT。Esk等人利用CRISPR-LICHT方法對基因突變是如何改變大腦細胞數量這一問題進行了分析。a、研究者設計了引導性RNA（gRNA）分子，每個分子與173個感興趣的基因中的一個進行結合。並且他們使用一種被稱為譜系條形碼（LB）的獨特DNA序列對每個gRNA分子進行了標記。b、然後將每個gRNA包裝成慢病毒（為了看起來更簡潔，這裡只顯示了三個gRNA包裝成的慢病毒），並使用慢病毒池感染人類胚胎幹細胞（hESCs）。c、隨後將細胞置於3D培養基中，並催生Cas9酶（該酶的目標是gRNAs，它能夠使gRNAs刪除每個受感染細胞中的基因；圖中未顯示）。細胞將被培養至40天，從而生成複雜的3D腦類器官。有些譜系細胞生長迅速，而另外一些譜系則大量減少（雜交）。d、隨後對類器官進行收集並選擇其中含有Cas9的細胞（圖中未顯示）。對這些細胞中的DNA進行擴增，並添加第二種獨特的DNA條形碼（細胞條形碼，CB）。然後按照gRNA和條形碼對這些DNA進行測序。LBs（譜系條形碼）是我們能夠精確測量每個譜系的大小，CBs（細胞條形碼）增加了我們挑選小譜系的能力。如果含有某一基因gRNAs的譜系一直很小（這裡可以參看基因2和基因3），那麼該基因很可能在腦細胞增殖中發揮作用。（圖源：nature）
研究人員對173個被認為引起患小頭畸形症風險的基因進行了譜系條形碼缺失排序，並對排名前32的基因進行了更為詳細的檢驗。他們利用混合策略研究了這32個基因在調節細胞增殖中所發揮的作用，該混合策略指的是，他們從控制細胞和經過基因編輯缺失了某一基因的細胞結合體中培養出類器官，並分析了完全長成的類器官中控制細胞與編輯細胞的比率。如果發現編輯過的細胞數量顯著減少，則表明基因缺失導致了細胞增殖的減少。在被研究的32個基因中，有25個被發現與細胞增殖有關。
最終，Esk等人集中研究了該基因集合中的一個特定基因，該基因主要負責的是編碼即時早期反應3相互作用蛋白1（IER3IP1）。當細胞被敲除該基因時，產生的類器官比對照類器官小。對缺乏這種基因的類器官的分析結果表明，該基因似乎是用來調節未摺疊蛋白反應的（即細胞內一種稱為內質網的細胞器對壓力的反應，這種反應會導致蛋白質合成的減少）。
使用一種能夠恢復蛋白質合成的被稱為整合應激反應抑制劑的小分子對細胞進行處理，會使類器官中神經前體細胞的大小和組織恢復正常。這些發現是非常有趣的，因為它們將壓力誘導的未摺疊蛋白反應（該反應此前被認為與Zika病毒相關的小頭畸形症8有關）與患有疾病的遺傳因素聯繫在一起。這些實驗強調了CRISPR-LICHT技術在研究神經發育障礙的機制方面的巨大潛力。
儘管Esk及其同事在研究中主要關注的是與小頭畸形症相關的基因，但是他們所使用的高性價比且省時的方法將廣泛適用於其他神經發育障礙。發育性腦部疾病基因資料庫(go.nature.com/3mezn8d)列出了約600個基因，這些基因的缺失與自閉症、精神分裂症和癲癇症等神經發育性障礙有關。現在，這些基因都可以通過CRISPR-LICHT技術篩選出來。
這種方法也可以通過調整基因來改變而不是消除基因表達，從而對神經發育障礙中低表達或過度表達的基因進行研究。除此之外，CRISPR-LICHT技術中所使用的雙條形碼技術也可以被用於創建和跟蹤在遺傳上有所區別的細胞群體，從而模擬大腦發育過程中細胞間遺傳變異所產生的影響9。最後，這種方法可用於分析與癌症相關的基因。
但是，這一方法也存在一定的局限性。CRISPR-LICHT技術最適用於與早期發育或細胞增殖相關的研究。本研究中的大腦類器官的生長時間為40天，這模擬的是人類在妊娠早期的大腦發育，因此沒有考慮後期發育成熟的神經元和膠質細胞。使用更長的分化時間，將會使周轉期增加。
除此之外，當前的類器官生成方案可能激活細胞的應激路徑，從而損害細胞類型規格及其準確性10。最後，並不是所有的皮層都是一樣的，不同的皮層區域有不同的細胞類型和連接，起著不同的作用。我們需要設計出更為精確的方案來對這種複雜性和區域化進行模擬。
除臨床研究外，CRISPR-LICHT平臺還可用於研究健康人腦進化過程中的遺傳變化及機制。有證據表明，人類皮層的擴張和摺疊取決於人類早期神經元發育的特性11-13。使用大腦類器官來篩選人類特有的或者在人類中表現出獨特活動模式的基因和其他DNA元素14，這可能是在人類神經發育的背景下，將基因與人類特徵聯繫起來的一種強有力的方法。
參考信息：
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原文作者：Adriana Cherskov & Nenad Sestan
編譯作者：UTCS（brainnews創作團隊）
校審：Simon（brainnews編輯部）