Science | 巨型噬菌體中的新CRISPR系統，有望帶來基因編輯新革命

2020-07-18 BioArt

撰文 | 木蘭之枻

責編 | 兮


以CRISPR-Cas系統為基礎的基因編輯工具讓相關研究領域有了革命性的突破。目前而言，DNA靶向的工具中，CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a（Cpf1）應用最為廣泛。不過現有工具依然存在諸多不足之處，其中，Cas蛋白的體積過大更是嚴重限制了其應用（SpCas9:1368胺基酸；SaCas9：1053胺基酸；Cas12a：1353胺基酸；Cas12b：1108胺基酸；）。


長期以來，研究者多在細菌中探尋新的CRISPR-Cas系統。2016年，Jennifer Doudna實驗室最先在古細菌中找到了新型的CRISPR-CasX及CRISPR-CasY系統，其擁有更小的體積（CasX：986胺基酸）並具有編輯細菌及人類細胞基因組的能力【1,2】（詳見BioArt報導：Nature長文丨Jennifer Doudna等報導新型CRISPR基因編輯工具）。這一發現讓研究者意識到，CRISPR-Cas系統的存在或許更加廣泛。

2020年7月17日，來自加州大學伯克利分校的Jennifer Doudna實驗室又有新發現，他們在Science發表題為CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor的論文。文章通過對巨型噬菌體的宏基因組數據進行挖掘，結果發現一類更加小巧的CRISPR-CasΦ（Cas12j）系統（700-800胺基酸），新系統不僅結構獨特，且在人源細胞和植物細胞中具有可觀的基因編輯能力，這為基因編輯工具的研發提供了新的可能。


Science | 巨型噬菌體中的新CRISPR系統，有望帶來基因編輯新革命


繼古菌中通過數據挖掘發現的CRISPR-CasX/Y系統後，巨型噬菌體的宏基因組又帶來新的驚喜，其編碼的CRISPR-CasΦ系統更加小巧。從進化關係而言，CasΦ或許更為「古老」，其與V型CRISPR-Cas蛋白的同源性不足7%，但與V型CRISPR-Cas蛋白的源頭TnpB核酸酶超家族的部分蛋白有更高同源性。研究發現，CasΦ藉助於單一嚮導RNA的引導，並依賴於PAM位點的指引以實現目標DNA的識別（其中CasΦ-2所識別的PAM序列為5』-TBN-3』（B=G,T,C））。

隨後的體外功能實驗證實，CasΦ依賴於C末端的RuvC功能域切割雙鏈DNA，其切割非靶鏈（NTS）的速度較靶鏈（TS）更快。研究還發現，CasΦ可通過順式或反式作用靶向並切割單鏈DNA（ssDNA），這一特性在核酸檢測研究中極具潛力（詳見BioArt報導：Nature | 快速、準確、經濟：CRISPR技術在疾病檢測中的崛起）。隨後的研究還發現，CasΦ可通過其RuvC功能域完成pre-crRNA的加工，這一特性迥異於其他V型CRISPR-Cas系統，它們或依賴於非RuvC功能域，或需藉助於額外的III型核糖核酸酶完成pre-crRNA的加工。

之後，研究者在EGFP穩定轉染的HEK293細胞系中證實，CasΦ-2和CasΦ-3均具有可觀的基因編輯能力，其中CasΦ-2在部分位點對EGFP的編輯效率可達33%。此外，植物原生質體中的實驗證實，通過核糖核蛋白複合物進行轉染時，CasΦ-2對擬南芥的PDS3基因亦具有相當的編輯能力。

總體而言，本研究在巨型噬菌體中發現了更為小巧的CRISPR-CasΦ系統，並在人源細胞系和植物細胞中表現出可觀的基因編輯能力；這一新系統的發現讓CRISPR相關的工具庫更加多樣化，也讓基因編輯工具的未來發展及應用有了更多可能。

原文連結

https://science.sciencemag.org/content/369/6501/333


參考文獻

1.Burstein D, Harrington LB, Strutt SC, Probst AJ, Anantharaman K, Thomas BC, et al. New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes. Nature. 2017;542(7640):237-41.

2.Liu JJ, Orlova N, Oakes BL, Ma E, Spinner HB, Baney KLM, et al. CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors. Nature. 2019;566(7743):218-23.

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