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細菌的防禦系統包括限制-修飾系統、CRISPR系統、感染流產系統等，是細菌抵禦天然宿敵噬菌體的重要防禦性武器。早在上個世紀，科學家們就對限制-修飾系統展開了研究，由此開發的限制性內切酶廣泛地應用於分子生物學領域。DNA磷硫醯化修飾是一類全新的限制-修飾系統，與傳統的DNA甲基化限制-修飾系統相比，該系統用硫原子替代了磷酸骨架上非橋連的氧原子。目前已知兩種磷硫醯化系統（細菌與古菌）的修飾部分均為Dnd蛋白編碼，僅在限制部分不同。
近日，武漢大學藥學院王連榮團隊在Nature Microbiology上發表了題為SspABCD-SspE is a phosphorothioation-sensing bacterial defence system with broad anti-phage activities的研究論文，報導了SspABCD-SspE組成的一種全新的磷硫醯化限制-修飾系統並對其防禦機理進行了深入探究。
圖1. DNA單鏈磷硫醯化修飾-感應修飾限制系統的工作機理以往發現的磷硫醯化修飾均位於基因組雙鏈DNA上。海洋弧菌FF75具有一類特殊的高頻單鏈磷硫醯化修飾並位於CPSCA核心序列。然而，在 FF75的基因組上沒有找到dnd基因簇，這促使研究者推斷FF75中可能存在一套全新的編碼單鏈磷硫醯化修飾的基因簇。通過比較基因組分析，對一段疑似基因簇進行了基因敲除，隨後將這個基因簇的四個基因異源表達到大腸桿菌DH10B中重現了單鏈磷硫醯化CPSCA修飾，證明這四個基因正是單鏈修飾編碼基因。研究者以單鏈修飾（Single-stranded phosphorothioation）來命名四個基因為sspA、sspB、sspC與sspD。鑑定出修飾基因後，研究者嘗試探索該修飾的生理意義。實驗過程中一個意外發現引起了他們的注意：4攝氏度保存的養菌平板，僅野生型FF75菌株可以緩慢生長，磷硫醯化修飾喪失的突變株生長受到抑制。轉錄組結果顯示這些生長抑制的突變株中SOS基因轉錄水平普遍上升，暗示在FF75中很可能存在一套識別CPSCA修飾的限制系統。經過蛋白組比對及大範圍基因敲除，鑑定出在sspBCD下遊的sspE基因編碼了單鏈磷硫醯化的限制系統。將單鏈磷硫醯化限制-修飾基因簇異源表達到大腸桿菌中，可以賦予宿主抵抗包括T1、T4在內的多種噬菌體的侵染。Southern blot結果顯示，該系統抑制了噬菌體DNA在宿主胞內的複製。最後，該研究解析了兩個新蛋白SspB與SspE的生化活性：（1）修飾蛋白SspB的結構與核酸酶FokI類似，具有DNA核酸酶活性，可以在DNA上引入單鏈缺刻；（2）限制蛋白SspE同時具有核酸酶與NTP水解酶活性。有趣的是，SspE的NTP水解酶結構域可以感知攜帶磷硫醯化修飾的DNA，顯示了磷硫醯化限制系統和修飾系統之間的功能耦合。研究者通過分析發現234株細菌基因組攜帶有該新型磷硫醯化限制修飾系統。細菌防禦系統與噬菌體的對抗與相互進化是生物演化史上精彩的範例。除了限制-修飾系統外，一些細菌的防禦系統，如CRISPR-Cas9系統，toxin-antitoxin系統等都在不同領域有所應用。然而近年的研究顯示，人們對於這些微生物防禦系統的了解還不夠全面。
該研究鑑定出了以CPSCA單鏈磷硫醯化修飾為特徵的一套全新的細菌防禦系統，並揭示了其限制性蛋白SspE是如何感應修飾的功能耦合機理。該研究拓展了磷硫醯化限制-修飾系統的多樣性，深化了對細菌防禦系統的認識，開拓了磷硫醯化修飾以及細菌防禦系統研究新的方向。另外，DNA除了由ATCG四種鹼基組成，構成編碼生命信號的遺傳物質之外，還有各種各樣的表觀遺傳修飾，在不改變DNA密碼的情況下對生命體進行調節。在細菌中，最常見的DNA修飾是由甲基轉移酶Dam介導的Gm6ATC甲基化修飾，它可以調控染色體複製的起始，DNA錯配修復以及相關基因的表達。上述工作，武漢大學博士生
熊嘯林、上海交通大學
吳更教授和武漢大學博士生
魏月為並列第一作者，
王連榮教授為通訊作者。2020年6月，武漢大學藥學院
王連榮團隊還與合作者在
PNAS上發表名為
Epigenetic competition reveals density-dependent regulation and target site plasticity of phosphorothioate epigenetics in bacteria的文章，
揭示了DNA磷硫醯化修飾的位點選擇性及其與DNA三維結構和DNA甲基化修飾的關係。研究者通過染色質免疫沉澱-測序（ChIP-seq）發現沙門氏菌中DNA磷硫醯化修飾蛋白DndACDE主要結合在基因組的GATC序列上，而不是結合在原本的修飾位點GAAC/GTTC上，而GATC序列正是DNA的m6A甲基化序列。通過質譜以及測序技術對含有或敲除甲基化酶Dam的細菌中DNA磷硫醯化修飾位點進行定量及定位分析，研究者發現當敲除甲基化酶Dam後，沙門氏菌中有一半的DNA磷硫醯化修飾位點從GAAC/GTTC序列轉移到了GATC序列上。這說明沙門氏菌的磷硫醯化修飾蛋白不僅具有修飾GAAC/GTTC的能力，還同時具有修飾GATC序列的能力。在有甲基化修飾的情況下，GATC序列上的甲基化阻止了Dnd蛋白對該序列進一步的磷硫醯化修飾，從而使沙門氏菌野生型表現出GAAC/GTTC類型的磷硫醯化修飾；而當甲基化缺失之後，Dnd蛋白由於沒有甲基化的影響而可以順利對GATC位點進行磷硫醯化修飾。另外，雖然甲基化缺失導致了磷硫醯化修飾位點發生位移，整個細菌基因組中磷硫醯化修飾的總量保持不變。圖2. 細菌基因組上磷硫醯化修飾位點分布示意圖。在有甲基化（紅色球）存在，基因組上主要磷硫醯化修飾（金色球）位點為GAAC/GTTC(外圈：桔色和黃色)，敲除Dam甲基轉移酶基因後，基因組上主要磷硫醯化修飾位點變為GATC（內圈：綠色）。
之後，研究者利用高通量DNA結構預測工具DNAShapeR對已發現的DNA磷硫醯化修飾位點迴文序列GNNC進行DNA結構相關的14個參數進行分析，發現整個中心序列可以分為GGCC/GCGC和GAAC/GTTC/GATC/GTAC兩個大類，說明不同細菌的Dnd蛋白偏好修飾不同結構的DNA。通過對鹼基堆積 (base stacking) 的特性minor groove width (MGW) 和 roll進行分析，發現不同細菌中DNA磷硫醯化修飾序列GAAC/GTTC/GATC/GGCC與其他無關序列GTAC/GCGC表現出明顯不同，說明與鹼基堆積相關的DNA結構特性更多的決定了DNA的磷硫醯化修飾頻率。而通過對含有磷硫醯化修飾細菌的進化樹分析，研究者也發現在同一株菌中，其磷硫醯化修飾與甲基化修飾識別的位點往往是不同的。該研究結合多種生物學以及計算機模擬等技術手段，揭示了DNA磷硫醯化修飾作為一個新型表觀遺傳修飾的獨特性質。DNA結構相似的GAAC/GTTC/GATC序列可以被DNA磷硫醯化修飾蛋白所識別，而GATC上面的甲基化修飾則可以阻礙DNA磷硫醯化系統修飾該位點，使得磷硫醯化修飾位點向GAAC/GTTC位點發生遷移。通常一個細菌中往往含有不止一種DNA修飾系統來行使限制修飾或者表觀遺傳的功能，
本研究闡明了在同一種細菌中兩種完全不同類型的DNA修飾之間的相互影響，證明了DNA磷硫醯化修飾的位點特異性與DNA結構的關係，也加深了我們對不同表觀修飾系統的相互作用的理解。上述工作，武漢大學博士研究生
武曉琳與曲阜師範大學教授
曹博為該論文的並列第一作者，武漢大學為第一作者單位，武漢大學
王連榮教授，波士頓大學
James E. Galagan教授以及麻省理工學院
Peter C. Dedon為共同通訊作者。
https://www.nature.com/articles/s41564-020-0700-6https://www.pnas.org/content/117/25/14322