核酸體外擴增是分子生物學研究的基礎。隨著生物技術的發展, 出現了越來越多的核酸體外擴增技術。根據其特點可分為三類: 一類是靶核酸的直接擴增, 如聚合酶鏈式反應等; 一類是探針擴增技術，如Cleavase/Invader Technology；另一類是信號放大擴增, 如HC2。本推送主要介紹靶核酸的直接擴增技術，全文主要翻譯自23版的Herry實驗室臨床診斷及管理。
PCR
聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction: PCR），是一種分子生物學技術，用於擴增特定的DNA片段。PCR由凱利·穆利斯發明，並於1993年獲諾貝爾化學獎。但PCR只能複製很短的DNA片段，通常不超過10kbp，但對於大多數IVD應用，這個長度已經足夠。其基本原理是在熱循環下分別進行變性、退火和延伸，目的是完成DNA雙鏈的解離、引物與模板DNA的結合，最終在DNA聚合酶的作用下延伸DNA子鏈。在經過N個循環後，目標DNA就完成了指數級擴增。
目前應用的聚合酶鏈式反應需要幾個基本組成：
DNA模板（template），含有需要擴增的DNA片段。
2個引物（primer），決定了需要擴增的起始和終止位置。
DNA聚合酶（polymerase），複製需要擴增的區域，其中最經典就是Taq酶，來自於水生棲熱菌。
脫氧核苷三磷酸（dNTP），用於構造新的互補鏈。
含有鎂離子的緩衝體系，提供適合聚合酶行使功能的化學環境。
聚合酶鏈式反應在熱循環設備中進行。PCR儀可以將反應管加熱或冷卻到每步反應所需的精確的溫度。為防止反應體系中液體產生蒸氣，通常在反應管上加蓋加熱的蓋子（比加熱板溫度來的高），或者在反應體系表面加入一層石蠟油。
逆轉錄PCR（RT-PCR）
PCR利用DNA聚合酶和熱循環完成了DNA的體外複製，但無法實現RNA的擴增。RT-PCR就是為了改善這一缺陷。通常，在RT-PCR中，首先使用逆轉錄酶將RNA模板轉化為互補DNA（cDNA）。然後將cDNA用作使用PCR進行指數擴增的模板。其中逆轉錄酶通常使用不耐熱的禽成纖維細胞病病毒逆轉錄酶（AMV-RT），DNA聚合酶和PCR一樣。當然，現在也存在單一酶的RT-PCR。
RT-PCR的難點在於RNA存在二級或三級結構，可能需要特殊條件或其他靶位點才能有效合成cDNA。目前常用的實驗方案有一步法和兩步法。一步法從cDNA合成到PCR擴增的整個反應都在單個試管中進行，通過把逆轉錄酶和DNA聚合酶一次性加入到反應管中，最大程度地減少實驗差異。兩步法需要在單獨的試管中進行逆轉錄酶反應和PCR擴增，儘管增加了反應步驟加大了汙染的可能性，但準確性和靈敏度更高，對RNA模板保護更好。
巢式PCR
由於常規PCR只使用2個引物，其決定了需要擴增的起始和終止位置，為了減少由於未預期的引物結合位點的擴增而導致產物中的非特異性結合，巢式PCR（Nested PCR）被開發出來。巢式PCR涉及兩組引物，用於連續兩次進行的聚合酶鏈反應，第二組引物用於擴增第一批產物中的第二個靶標。這樣可以在第一輪擴增時進行少量擴增，從而限制了非特異性產物。第二套嵌套引物只能從第一輪擴增中擴增出目標產物，而不是非特異性產物。這樣可以運行更多的總周期，同時最大程度地減少非特定產品。這對於稀有模板或具有高背景的PCR很有用。
巢式PCR的好處在於，如果第一次擴增產生了錯誤片段，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對並擴增的概率極低。因此，巢式PCR的擴增非常特異。巢式PCR比較經典的例子是FilmArray的微流控分子診斷系統，在之後的微流控呼吸道疾病診斷會進行詳細分析。
多重PCR
多重PCR本質上和PCR類似，只是為了一次性完成多種靶標的擴增，在同一PCR反應體系裡加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應。其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR相同。由於PCR使用的酶都一樣，所以多重PCR只需要對引物進行設計。多重PCR最大的難點就在於必須優化所有引物的設計，以便所有引物在同一溫度循環下都能夠正常工作。
實時螢光定量PCR（q-PCR）
前面介紹的多種分子擴增技術基本都基於凱利·穆利斯PCR體系的改進，而實時螢光定量PCR算是新一代的PCR技術。實時螢光定量PCR可以在PCR期間（即real-time）監控目標DNA分子的擴增，而不是像常規PCR一樣在末端監測（end-point）。很多人把實時螢光定量PCR的縮寫為RT-PCR，但標準的寫法是q-PCR，RT-PCR是逆轉錄PCR。
q-PCR根據螢光的來源可分為染料法和螢光探針法。染料法使用DNA結合染料，其能夠與所有雙鏈（ds）DNA結合，從而增加了染料的螢光量子產率。因此，PCR期間DNA產物的增加導致每個循環中測得的螢光強度增加。但是，dsDNA染料（例如SYBR Green）將與所有dsDNA PCR產物結合，包括非特異性PCR產物（例如Primer二聚體）。這可能會干擾或阻止對目標靶序列的準確監控。
螢光探針法僅檢測含有與該探針互補的DNA，可有效增加特異性，該方法依賴於螢光標記的DNA探針，該探針的一端具有螢光報告基因，而在探針的另一端具有螢光猝滅劑。報告分子與淬滅劑非常接近，由於螢光共振而無法檢測到螢光。Taq聚合酶的5'到3' 核酸外切酶活性導致的探針斷裂破壞了報告基因與猝滅劑的鄰近性，因此允許螢光的非猝滅發射，可以在用雷射激發後進行檢測。
目前，同樣的理念可用於開發實時螢光RT-PCR。通過添加多種引物，可開發實時螢光多重PCR。
數字PCR
數字PCR即Digital PCR（dPCR)，是一種核酸分子絕對定量技術。相較於qPCR，數字PCR能夠直接讀出DNA分子的個數，是對起始樣品核酸分子的絕對定量。目前dPCR主要有兩種形式，晶片式和液滴式，但基本原理都是將大量稀釋後的核酸溶液分散至晶片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數少於或者等於1個。這樣經過PCR循環之後，有一個核酸分子模板的反應器就會給出螢光信號，沒有模板的反應器就沒有螢光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。詳細的介紹可查看之前的推送。
TMA
前面介紹的PCR系統都需要在反應過程中對溫度進行控制，反應時間往往決定於熱循環的速度。轉錄介導擴增TMA是一種等溫的核酸擴增系統，由Gen-Probe公司研發，於2012年8月被Hologic收購。TMA利用RNA聚合酶和逆轉錄酶，以RNA為模板在約42 oC等溫反應條件下進行擴增，產物為RNA。該技術在每一循環可產生模板的100-1000個拷貝轉錄本。
轉錄介導等溫核酸擴增是針對靶序列設計一對特異性引物，其中啟動子引物（Promoter primer）上具有 T7 RNA聚合酶識別的啟動子序列，這一引物與靶序列結合後，在反轉錄酶的作用下進行反轉錄反應，形成 RNA/DNA雜交分子。反轉錄酶所具有的RNase H活性可以水解 RNA/DNA雜交分子，形成單鏈NDA，該單鏈 DNA含有T7 RNA聚合酶識別的啟動子序列。然後引物 2與單鏈DNA結合，通過反轉錄合成雙鏈DNA。T7 RNA聚合酶結合在啟動子上，以DNA為模板進行轉錄，由一分子DNA模板可得到100-1000拷貝轉錄本，這些轉錄本又進入反應，作為轉錄介導等溫核酸擴增的起始模板，重複上述步驟。
NASBA
基於核酸序列的擴增NASBA是另一種基於轉錄（Transcription-based amplification）的核酸擴增技術。NASBA由J Compton在1991年開發，其技術原理和TMA類似，因此很多技術文章把它們都放到一起討論。
環介導等溫擴增技術LAMP
LAMP是另一種等溫擴增技術，其溫度相對於TMA和NASBA高（60-65度）。LAMP法的特徵是針對靶基因上的六個區域設計四條引物，利用鏈置換型DNA聚合酶在恆溫條件下進行擴增反應。LAMP最大的優點是操作簡單，且靈敏度和特異性也高，結果可通過肉眼觀察白色沉澱或者檢測綠色螢光判斷，常用於開發POCT系統。
但LAMP的通用性不如PCR，且多路復用性差。引物設計是LAMP的一個難點，且受到眾多限制，常常依賴於自由，開源或商業軟體用於協助LAMP引物設計。
解旋酶依賴性擴增HDA
HAD是一種等溫擴增技術，其由BioHelix開發。首先，雙鏈DNA被DNA解旋酶分開，並被單鏈DNA（ssDNA）結合蛋白包被。在第二步中，兩個序列特異性引物與DNA模板的每個邊界雜交。然後使用DNA聚合酶將退火的引物延伸至模板，以產生雙鏈DNA，然後將兩種新合成的DNA產物用作DNA解旋酶的底物，進入下一輪反應。
HDA的優點在於，它提供了在不需要熱循環儀的等溫溫度下對特定靶標進行核酸擴增的快速方法。但是，研究人員需要事先優化引物和緩衝液。
其它等溫擴增方法還有Nicking Enzyme Amplification Reaction (NEAR)、Rolling circle amplification（RCA）、Recombinase Polymerase Amplification（RPA）、Strand-displacement amplification (SDA)等。