PCR擴增分離目的DNA片段

2021-01-07 生物谷

一、目的
了解多聚合酶鏈反應DNA 擴增技術的基本原理和實驗應用，掌握PCR反應基本技術。
二、原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈式反應是1986 年由Kallis Mullis 發現。這項技術已廣泛地應用於分子生物學各個領域，它不僅可用於基因分離克隆和核酸序列分析，還可用於突變體和重組體的構建，基因表達調控的研究，基因多態性的分析，遺傳病和傳染病診斷，腫瘤機制探查，法醫鑑定等方面。PCR技術已成為方法學上的一次革命，它必將大大推動分子生物學各學科的研究發展。
PCR是一種利用兩種與相反鏈雜交並附著於靶DNA兩側的寡核苷酸引物經酶促合成特異的DNA 片段的體外方法，由高溫變性，低溫退火和適溫延伸等幾步反應組成一個循環，然後反覆進行，使目的的DNA 得以迅速擴增，主要過程如圖6。置待擴增DNA 於高溫下解鏈成為單鏈DNA 模板；人工合成的兩個寡核苷酸引物在低溫條件下分別與目的片段兩側的兩條鏈互補結合；DNA聚合酶在72℃將單核苷酸從引物3'端開始摻入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新鏈。由於每一循環所產生的DNA均能成為下一次循環的模板，所以PCR 產物以指數方式增加，經25—30次周期之後，理論上可增加109倍，實際上可增加107倍。
PCR 技術具有操作簡便、省時、靈敏度高特異性強和對原始材料質量要求低等優點，但由於所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能糾正反應中發生的錯誤核苷酸摻入，估計每9000個核苷酸會導致一個摻入錯誤，不過Innis M·A 發現，錯誤摻入的鹼基有終止鏈延伸的作用傾向，使得錯誤不會擴大。

圖3－4 PCR 原理示意圖
PCR 技術應用廣泛，不可能有這樣一套條件滿足所有的實驗，但本實驗所介紹的方法可適應於大多數DNA 擴增反應，即使有的不適應，至少也確定了一個共同的起點，在此基礎上可以作多種變化。不過下列因素在實驗應用時應予以特別注意，以求取得滿意結果。
1、模板：單、雙鏈DNA 和RNA都可以作為PCR樣品，若起始材料是RNA，須先通過逆轉錄得取第一條cDNA。雖然PCR 可以僅用極微量的樣品，但為了保證反應的特異性，一般宜用ng 量級的克隆DNA，ug 級的染色體DNA，待擴增樣品質量要求較低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制劑以及能結合DNA 的蛋白質。
2、引物：引物是決定PCR 結果的關鍵，下列原則有助於引物的合理設計。（1）儘可能選擇鹼基隨機分布，GC 含量類似於被擴增片段的引物，儘量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它異常序列的引物。（2 ）避免具有明顯二級結構（尤其是在引物3'—末端）的序列。
（3 ）防止引物間的互補，特別要注意避免具有3'末端重疊的序列。
（4）引物的長度約為20個鹼
基，較長引物較好，但成本增加，短引物則特異性降低。
（5）引物濃度不宜偏高，過高易形

 

 

成二聚體，而且擴增微量靶目標或起始材料是粗製品，容易產生非特異產物。
3、緩衝液：PCR緩衝液的變化通常會影響擴增結果，特別是MgCl2，其濃度對專一性和擴增量有重大影響，通常最適濃度為1.5mM左右（每種dNTP 的濃度為0.2mM時），濃度過高，使反應特異性降低；濃度過低，使產物產量降低。四種dNTP 濃度通常每種都是0.05mM—0.2mM。過高的濃度會導致錯誤摻入，濃度過低，則影響反應產物的產量。四種dNTP濃度應大體相同，其中一種若偏高，會誘發錯誤摻入，降低合成速度，過早終止延伸反應。另外dNTP 能與Mg 2 結合，使游離Mg2 濃度降低，所以如果dNTP 的濃度有很大改變，MgCl2濃度也要改變。Taq聚合酶是一種耐高溫聚合酶，用量通常是1—4 單位/100ul，濃度過高，產生過多的非特異片段。
4、循環參數：PCR 循環是把起始材料加熱到90—95℃，保持短時間使雙鏈DNA 解鏈；然後冷卻至37—55℃，使引物與模板退火；再升溫至70—75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下摻入單核苷酸，使引物沿模板延伸。解鏈不完全是導致PCR 失敗的最主要原因。用DNA擴增儀時，94℃保持1 分鐘可使模板的起始物完全變性。若用低於94℃的條件，則應適當延長時間。引物與模板退火溫度由引物的長度及G C含量決定。適時間退火（1—2）分鐘有利於產物的特異性。引物延伸在70—75℃保溫的時間可根據擴增DNA片段的長短來調節。正常情況下，每分鐘可延伸1Kb 的長度，常規PCR 一般為25—40 個循環，若循環加長，則由於酶活性降低，聚合時間延長，引物及單核苷酸減少等原因，反應後期容易產生錯誤摻入，所以在滿足產物得率前提下，應儘量減少周期次數。

 

三、材料
（一）儀器與器皿
PRC 擴增儀（PE2400），瓊脂糖凝膠電泳設備，微量取樣器，一次性指形管，凝膠成像儀 玻片
（二）試劑與材料
1．瓊脂糖凝膠電泳試劑
1）電泳緩衝液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0 0.002mol/L EDTA
2）加樣緩衝液：0.25%溴酚蘭40% w/v蔗糖
3）溴化乙錠溶液：0.05mg/ml溴化乙錠/水
4）瓊脂糖
2．TaqDNA 多聚酶
3．5´反應緩衝液：
125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/ml gelatin；125mmol/L(NH4)2SO4； Formamide 25%
4．混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2mmol/L)
5．DNA 模板（每2´ ml 中含有10fg 待擴增DNA）
6．引物 1 （25pmol/L），5』加入EcoRI 粘性末端鹼基
7. 引物 2 （25pmol/L），5』加入HindIII 粘性末端鹼基
8.無菌水
四．實驗步驟
1.按順序在200ml 指形管中加入以下試劑與樣品：（因購入的試劑批次不同，加樣時有
所差別，以預實驗結果為準。）
1） ddH2O 74ml
2） 10´Buffer 10ml
3） MgCl2 6ml（10´Buffer 如已加入MgCl2，則不必加）
4） dNTP 2ml
5） 引物1 2ml
6） 引物2 2ml
7） 模板 2ml
8） TaqDNA聚合酶2ml
總體積共100ml（也可以配成40ml 的反應體系）
2.在PCR 擴增儀上按以下反應條件編入程序：（以下為參考值，因擴增的DNA片段不同，
各類PCR 擴增儀程序設定各不相同，編程過程視擴增的DNA 片段的要求及儀器而定參數，見
示範。）
1．預變性 94℃ 2 分種
2．循環條件（30 次）
變性 94℃ 40 秒
復性 55℃ 35 秒
延伸 72℃ 2 分10 秒
3．延長延伸 72℃ 7 分鐘
編完反應程序，置反應管於PCR擴增儀的反應孔中，開動機器，擴增循環反應開始。
3.PCR 擴增完畢，配2%瓊脂糖凝膠，取15ml 反應液及相適應的PCR mark 分別點樣，
加樣緩衝液應為40%W/V 蔗糖，電泳觀察結果。
4.凝膠成像儀或紫外燈下觀察實驗結果，是否已擴增到實驗設計的DNA 片段。

 

相關焦點

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    原理不同：螢光定量PCR實時監測與DNA結合的螢光染料激發的螢光;普通pcr通過檢測插入dna中螢光染色劑來看是否有目的片段。 　　應要求：螢光定量對擴增片段有較高的要求，一般為100-300bp;普通PCR可以擴增長點的片段。螢光定量可以不進行電泳就對產物進行定量分析，普通PCR必須電泳。
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    pcr擴增在做實驗的時候是經常用到的，它是基礎實驗，是每個做實驗的人都應該掌握的，下面小編就來說一下PCR擴增的原理和步驟吧。1.pcr擴增的基本原理是PCR技術和DNA的天然複製過程基本是一樣的，其靶序列兩端互補的寡核苷酸引物與其特異性依賴於與DNA的半保留複製。
  • 目的基因的PCR擴增
    ⬇ 94℃ 30s   55℃ 30s             }  30cycles       72℃ 1min         ⬇72℃ 10min         ⬇4℃ forever 3、  檢測PCR產物取5μlPCR擴增反應液
  • 通過轉錄組技術而測序的dna序列被稱為「dna受體」
    後面的dna受體可通過做dna晶片credit-sweep來獲得，後面的dna受體包括mirna,smallmrna，circrna和ae等。根據技術的不同，dna晶片可以分為三類：測mirna：測定mirna。測dna受體的全雙工轉錄信號的兩轉錄本等等。測vxrna：測vxrna。
  • 長片段PCR擴增中幾個常見問題的解決辦法
    沒有擴增產物 1)在提供氯化鎂緩衝液中,以0.25mmol/L為梯度增加氯化鎂濃度, (2)泳道中出現模糊條帶,如果DNA模板中存在RNA,按上訴提示濃度補加氯化鎂,因為在PCR反應中可能缺少游離的鎂離子. (3)在融化試劑時,將第三緩衝液在15-25度溫育後混勻,若還有晶體狀物質,放置過夜混勻後可再次使用.
  • 我叫極速PCR試劑盒,這是我的說明書
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  • 將全部擴增反應產物通過瓊脂糖凝膠電泳分離並切膠回收純化DNA
    解決方案：某些時候使用帶有Gateway尾端的引物進行的PCR不僅能產生目的片段，同時還可能產生由於引物之間發生復性而非引物與模板之間復性導致的引物二聚體。由此產生的短鏈DNA片段可能與Gateway位點發生作用，進而幹擾首選的長插入片段的克隆。
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    實驗原理 　　瓊脂糖凝膠電泳鑑定PCR擴增產物。(原理參照瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA實驗) 　　本實驗使用了TaKaRa公司的膠純化試劑盒(Agarose Gel DNA Purification Kit)，該試劑盒是從瓊脂糖凝膠中回收並純化DNA片段的試劑盒。
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    PCR技術，即聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是一種用於擴增目標DNA的重要研究工具，由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學獎）建立。
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