長片段PCR擴增中幾個常見問題的解決辦法

2020-11-28 中國教育裝備採購網

1. 當PCR結果不滿意時,考慮以下幾個方面

(1)將PCR反應的試管與反應板緊貼,

(2)使用50ul或更少反應體系時,勿使用AmpliWax,兩個反應混合液=的操作方式在大多數情況下很有效,

(3)當酶反應混合物以70度"熱啟動"開始循環時,切記在加入酶後稍微振蕩一下,因為在0.2ml的PCR管不能均勻傳熱.

(4)不要隨意減少dNTP的用量,必需與其他成分保持平衡.

2. 沒有擴增產物

1)在提供氯化鎂緩衝液中,以0.25mmol/L為梯度增加氯化鎂濃度,

(2)泳道中出現模糊條帶,如果DNA模板中存在RNA,按上訴提示濃度補加氯化鎂,因為在PCR反應中可能缺少游離的鎂離子.

(3)在融化試劑時,將第三緩衝液在15-25度溫育後混勻,若還有晶體狀物質,放置過夜混勻後可再次使用.

(4)檢查退火溫度和變性條件,如果需要可降低退火溫度.

(5)檢查模板和引物的用量.增加循環次數和/或模板DNA的用量.

3. 泳道中出現模糊條帶

(1)減少循環次數或模板DNA的用量,

(2)提高退火溫度,單不要超過68度,

(3)重新設計引物或設計更長的引物.

4. 其他值得注意的條件

1)建議使用0.2ml的薄壁管,因為厚壁管在92度時不能有效的使模板變性.

(2)最佳反應體積為50ul,最好泳30ul礦物油覆蓋,

(3)在大多數反應中,0.75ul(0.5-1.0ul)的酶量可以得到滿意的結果,

(4)建議使用1.75mmol/L氯化鎂:350mmol/LdNTP或2.25mmol/L氯化鎂:500LNTP組合的混合物,要得到最佳結果,優化鎂離子的濃度是必需的.

(5)基因組DNA模板的質量顯著影響PCR反應,因此最好泳瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的長度.DNA片段長度可以超過50KB,傳統的基因組DNA能擴增片段至10KB,要擴增更長的片段應使用超純或高分子量的DNA.

(6)降低二級結構和引物二聚物形成的可能性.進行長片段PCR擴增時,引物長度一般為24-34個核苷酸,熔點在63-68度之間,使用這類引物可提高PCR反應的退火溫度來增加反應的特異性,這點非常重要,長片段擴增的效果往往受到非特異性短片度優先擴增的影響,變性:第一步變性在92-94度下進行2分鐘,在循環過程中儘可能減少變性時間(92-94度下19秒),除非模板中富含GC,則95度下變性30秒,這可以防止DNA脫平嘌呤核鏈斷裂,對於需擴增的基因組DNA片段終長度超過12KB時,應儘可能降低變性溫度.

(7)延伸:68度下進行延伸.

(8)循環延伸:儘量採用循環延伸的條件,若PCR儀無此功能,則必需增加延伸的時間.

(9)長片段PCR系統擴增的片段其3-末端油一個突出的A,因此建議採用T/A克隆.若進行平端克隆,可用Klenow酶或T4DNA多聚酶將PCR產物補平後在進行.

(10)測序時因酶的混合物帶有3-5外切酶活性,用Sanger方法進行測序不能產生均一的(染色體)帶型.

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