「實驗」PCR擴增目的片段

2021-01-07 小客生活

一、實驗目的

1.掌握PCR反應的原理。

2.掌握PCR反應操作及PCR儀的使用。

二、實驗原理

1.PCR的基本原理

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）：是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。它不僅可用於基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究，還可用於疾病的診斷。

PCR基本原理：類似於DNA的體內複製。在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在條件下依賴於DNA聚合酶的酶促合成反應。

PCR的基本步聚：

1、變性(Denaturation)：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。

2、退火(Annealing)：當溫度突然降低時，反應體系中引物和其互補的DNA模板在局部形成雜交鏈。

3、延伸(Extension)：在DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在條件下，5』→3』的聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應。

這種熱變性-復性-延伸的過程就是一個PCR循環，PCR就是在合適條件下的這種循環的不斷重複。

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至95℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板DNA鏈。

每完成一個循環需2-4min，2-3h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

三、儀器與試劑

PCR儀

PCR反應體系：

PCR反應成分：引物、Taq DNA聚合酶、4種dNTP混合物、Mg2+、10×緩衝液

1）模板：pET30a質粒DNA

一般100ng DNA模板/100L。模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。最好做濃度梯度對照從而確定最佳條件。

2）引物

a.濃度：0.1-0.5M（濃度過高易導致模板與引物錯配，反應特異性下降）

b.上遊引物序列：5-TAATACGACTCACTATAGGG-3

下遊引物序列：5-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3

引物是PCR特異性反應的關鍵；

PCR產物的特異性取決於引物與模板脫氧核糖核酸互補的程度；

人工合成的寡聚核苷酸引物需經離子交換HPLC進行純化。

3）Taq DNA聚合酶：一般0.5-2.5 U/50μl

酶量過少影響反應產量；濃度過高可引起會造成雜帶、特異產物帶不清晰等不好的結果，濃度過低則得不到所需的產物。最可靠的做法是先做濃度對照,再根據結果決定最佳條件。

4）dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP）

dNTP濃度取決於擴增片段的長度；

四種dNTP濃度應相等；

PCR常用的濃度為50-200μM，不能低於10-15μM。

濃度過高會抑制Taq酶的活性，易產生錯誤鹼基的摻入，濃度過低則降低反應產量。

5）10×PCR緩衝液 (Mg2+)：500 mM KCl，100 mM Tris-HCl (pH 8.4)，150 mM MgCl2，1 mg/ml明膠。

四、實驗步驟

1.PCR反應體系：總體積30μl

2 x premix Taq：15μl

上遊引物：1.5μl

下遊引物：1.5μl

質粒DNA模板：2μl

雙蒸水：10μl

2.PCR擴增程序：

98℃：3min

98℃：10S

58℃：10S

72℃：15S（第二到第三步30cycles）

72℃：2min

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