PCR技術,即聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)是一種用於擴增目標DNA的重要研究工具,由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年(1993年獲諾貝爾化學獎)建立。這項技術可在試管內的經數小時反應就將特定的DNA片段擴增數百萬倍,這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義,極大地推動了生命科學的研究進展。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:
模板DNA的變性:模板DNA經加熱至94℃左右一定時間後,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應做準備;
模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈後,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;
引物的延伸:DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按鹼基配對與半保留複製原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留複製鏈。
PCR技術自建立以來,經過不斷的優化,已經在生命科學領域得到了廣泛的應用,在某些研究和應用領域也是不可獲取的一個關鍵技術。不過,其反應過程中對高溫的依賴,也在一定程度上限制了其應用範圍,比如在臨床、食品和環境檢測中的快速應用。
近日,來自東京工業大學、雅培日本以及日本電氣通信大學的研究者報導了一種能夠在常溫(37°C/98.6°F)實現對DNA進行百萬倍擴增和雜交的方法。
該項被稱為L-TEAM(Low-TEmperature AMplification)的方法歷經科學家五年的研究,相比傳統的PCR有多項優勢。
憑藉其便利的「一步法」設計,L-TEAM有效避免了高溫變性和退火的步驟,也無需藉助常規PCR所需要的特定儀器。這種高效低成本的方法能夠防止蛋白質變性,因此對活體細胞實時分析提供了一種新的路徑。
在發表於《有機與生物分子化學》(Organic & Biomolecular Chemistry)雜誌,題為「Leak-free million-fold DNA amplification with locked nucleic acid and targeted hybridization in one pot」的研究中,研究者將一種名為鎖核酸(locked nucleic acids,LNAs)的合成分子引入到了DNA鏈,而這種合成分子能夠讓DNA在雜交過程中變得更加穩定。
另外,加入LNA以後還帶來了另一種意外但有益的結果。研究團隊觀察到DNA非特異性擴增的情況(註:原文是leak DNA amplification,如有更恰當中文表述,歡迎文末留言)有所減少,而這是DNA擴增研究中長期困擾科學家的一個問題。這就意味著,LNA能夠減少疾病診斷中的錯誤也就是假陽性情況的出現。
東京工業大學副教授Ken Komiya表示:「發現LNA在克服DNA擴增反應中常見的非特異性擴增問題中的新作用,我們很意外。我們計劃進一步詳細探究非特異性擴增背後的機制,並進一步改善L-TEAM技術的靈敏度和速度。」
預計在不久的未來,該技術也可以用來檢測短鏈核酸如microRNA,以助力醫學診斷,尤其是在POCT檢測和疾病早期診斷方面將會發揮重要作用。在腫瘤檢測領域,microRNA作為非常具有潛力的生物標誌物,正日益受到業界的認可。
此外,研究人員也表示,L-TEAM技術也將會被應用於DNA計算和DNA控制分子機器人。最初研究該技術的動力是建立一種新的擴增模式以構建高級分子系統,而這種系統能夠讓科學家對生物活體運行機制進行研究。
參考資料:
1.Leak-free million-fold DNA amplification with locked nucleic acid and targeted hybridization in one pot
2.A rapid, easy-to-use DNA amplification method at 37 Celcius
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