PCR技術作為實驗室的入門級技術，卻經常困擾各位實驗大神們。雖然度過了初學者們少加漏加PCR體系的階段，但很多奮戰在實驗室一線的小夥伴正遭遇著PCR非特異性擴增的尷尬事件。為了解決這個問題，有多少人曾經把退火溫度從50℃試到70℃、重新合成過引物、換過模板、換過全新的電泳緩衝液，或者還帶著滿腔的憤怒捏碎過電泳膠？今天老談來教教大家如何對非特異性擴增嗤之以鼻！
——by老談
給各位小夥伴腦補一下非特異性擴增，即進行PCR所擴增出來的條帶不是所要的，引物與模板在非目的條帶處有錯配，導致延伸產物不是目的條帶。例如引物二聚體，即引物在退火過程中產生了hairpin結構或其他二級結構，或者引物在模板的某些位置非特異性地結合，也同樣會產生非特異性擴增。
我們都知道，PCR產物都是通過引物延伸產生的。當引物產生了二聚體或者非特異性擴增產物之後，引物本身就無法再延伸形成PCR產物了，這樣的情況下，非特異性擴增產物越是多，那目的產物就越是少。如果在qPCR過程中，就會在熔解曲線中形成雙峰。
小夥伴們遇到這樣的問題，首先想到的可能是加入DMSO來阻止引物二聚體形成，或者EDTA來調節體系的離子濃度。但是具體問題具體分析，我們不能病急亂投醫，這裡老談給小夥伴們整理了解決方法，希望可以幫助大家快速、準確的搞定這個「小問題」。
１、引物設計的過程中要用Primer premier 5.0來驗證一下二聚體；
2、 引物合成後，先做一次梯度PCR，檢測最合適的退火溫度，一般高退火溫度可以提高引物對模板的特異性從而降低引物二聚體；
3、 降低Mg2+濃度，鎂離子濃度高，會導致大量的非特異性擴增，但是沒有鎂離子的話，也會導致Taq酶的失活；
4、降低dNTP濃度，dNTP也是非特異性擴增的一個罪魁禍首，降低它的濃度，也能有效降低二聚體及其他非特異性擴增；
5、降低引物濃度，一般的PCR引物都是過量的，降低了引物濃度自然也能降低引物之間形成二級結構的可能性；
6、提高退火溫度，這個道理很簡單，引物的退火溫度提高，引物間的二級結構形成可能性就會降低；
7、延長退火時間，這個也可以減弱引物間結合的可能性；
8、DMSO及甜菜鹼，這些PCR促進劑，主要是用於CG含量高的模板上，降低DNA的二級結構的產生，但根據經驗，加入DMSO之後需要同時提高一點退火溫度來補平（qPCR不太適用）；
9、熱啟動法，通過95℃的高溫熱啟動，高溫解鏈，使得引物間的二級結構破壞，以此降低二聚體產生。
回復「PCR」還有更多常見問題解析等著大家，希望對各位小夥伴有所幫助。